ブログ

Dec 15, 2023

ライン

Rapporti scientifici Volume 13,

Scientific Reports volume 13、記事番号: 1537 (2023) この記事を引用

1625 アクセス

7 オルトメトリック

メトリクスの詳細

長鎖散在エレメント 1 (LINE-1) オープン リーディング フレーム 1 タンパク質 (ORF1p) の発現は、高悪性度漿液性卵巣癌 (HGSOC) を含む多くの種類の癌に共通の特徴です。 今回我々は、ORF1pが卵巣がん細胞や原発腫瘍細胞によって発現されるだけでなく放出されることを報告する。 免疫多重反応モニタリング質量分析アッセイでは、放出された ORF1p が馴化培地、腹水、患者の血漿中で確実に検出可能であることが示され、ORF1p が潜在的なバイオマーカーであることが示唆されました。 興味深いことに、ORF1p の発現は HGSOC の卵管 (FT) 上皮前駆細胞では検出可能ですが、良性 FT では検出されず、ORF1p の発現が HGSOC 発生の初期のイベントであることを示唆しています。 最後に、FT 細胞を DNA メチルトランスフェラーゼ阻害剤で処理すると、ORF1p が強力に発現および放出され、非腫瘍形成組織における LINE-1 抑制における DNA メチル化の制御的役割が検証されました。

卵巣がんは依然として先進国におけるがん関連死亡の主な原因であり、世界中で年間約 18 万人が死亡しています1。 米国単独でも、米国がん協会は、2022 年に卵巣がんにより新たに 19,880 人が発症し、12,810 人以上が死亡したと推定しています2,3。 卵巣がんは不均一な疾患であり、最も一般的なサブタイプは高悪性度漿液性卵巣がん (HGSOC) です4。 HGSOC 患者のほとんどは進行した疾患を抱えて治療を受けていますが、その時点で一次治療後に寛解が長引くことはまれで、再発は化学療法抵抗性の増加によって特徴付けられます。 したがって、死亡率を低下させるために、卵巣がんの早期発見のための改善された戦略が切実に必要とされています5,6。 残念ながら、生存率を向上させる十分な感度と特異性を備えたスクリーニング検査はまだ開発されていません。 現在、卵巣疾患の評価に利用できる最良のツールは経膣超音波 (TVS) です。 しかし、複数の大規模研究では、TVS をスクリーニングツールとして使用するのに十分な感度と特異性を実証できていません 7,8。 CA-125 と HE4 は卵巣がんの特徴がよく知られているバイオマーカー 9、10、11、12、13 ですが、それらの臨床応用は現在、治療効果の分析と病気の再発の検出に限定されています 14。 英国卵巣がんスクリーニング共同試験（UKCTOCS）研究の最近の結果は、卵巣がんリスクアルゴリズム（ROCA）、経膣超音波検査、および臨床評価を使用して解釈される血清CA-125を用いた集学的スクリーニングが早期への移行につながる可能性があることを示唆しています。 -ステージの検出と治療15. 残念なことに、UKCTOCS 研究の長期追跡調査では、マルチモーダルスクリーニングで見られたステージ III または IV の発生率の減少が救命につながらなかったことが示されました 16。 卵巣がんの約 20% は CA-125 を産生せず、このバイオマーカーのみに依存したアプローチでは見逃される可能性があることに注意することが重要です 17。 これらの発見を総合すると、疾患生物学のより完全な理解に由来する、広く適用可能なバイオマーカーを同定する必要性が強化されます。

プロテオミクス技術の進化により、腫瘍微小環境内の常在細胞型によって間質腔に放出されるタンパク質の系統的な特性評価を行うことが可能になりました。 組織間質液 (TIF) は、血管と周囲の組織細胞の間の液体で構成され、人体の重量の 16% を占め、新規かつ非常に有望なバイオマーカー源となります 18。 我々は最近、正常卵管（FT）上皮由来のTIFと一致するHGSOCのプロテオームワイド解析を完了した（Gillette et al.、原稿準備中）。 HGSOC の TIF で最も区別して検出されるタンパク質の中に、長鎖散在エレメント 1 (LINE-1) レトロトランスポーザブル エレメント ORF1 タンパク質 (ORF1p) があります。

転移因子 (TE) は、DNA トランスポゾンとレトロトランスポゾンという 2 つの主要なクラスに分類できます。 レトロトランスポゾンは、ヒトゲノム内で最も豊富な TE であり、逆転写されて新しいゲノム位置に挿入される RNA 中間体を介して自己増殖します 19。 レトロトランスポゾンは、長い末端反復配列 (LTR) の有無によって区別される 2 つのグループにさらに分類できます。 ヒト TE の大部分は、LINE-120 に代表される非 LTR レトロトランスポゾンの現在および過去の活性を反映しています。 LINE-1 エレメントは、最も豊富で唯一活性のあるタンパク質をコードするレトロトランスポゾンであり、ヒトゲノムの約 17% を占めます。 ヒトゲノムには、およそ 500,000 の切断されたコピーと 6,000 の完全長 LINE-1 コピーが存在します 22。 転写は、CpG ジヌクレオチドが豊富な内部 RNA ポリメラーゼ II プロモーターによって駆動されます 21,22 が、ヒト成人細胞での発現は通常、DNA メチル化によって抑制されます 20。 興味深いことに、LINE-1 DNA メチル化の喪失は、卵巣癌や他の種類の癌で見られる一般的な表現型です 19。

LINE-1 には 2 つのオープン リーディング フレーム (ORF) が含まれています。ORF1 は RNA 結合タンパク質 (ORF1p) をコードし、ORF2 は逆転写酵素およびエンドヌクレアーゼ活性を持つタンパク質 (ORF2p) をコードします 21,23。 ORF1p の異常発現は、卵巣 24、25、26、27、28、29、30、31 を含む上皮がんにわたる多くの研究で報告されており、ORF1p を有望ながんバイオマーカーにしています。 がん細胞では高レベルの ORF1p が検出されているにもかかわらず、標準的なタンパク質検出方法を使用して ORF2p の発現が示されたことはありません 32。

本研究では、ORF1p が HGSOC および原発腫瘍細胞株によって発現されるだけでなく放出されることを示します。 当社は、ならし培地、腹水、および患者血漿中の分泌された ORF1p を検出するために、標的質量分析法と組み合わせたペプチドレベルアッセイ (Immuno-MRM、iMRM33、34、35、36、37、38、39、40) での免疫親和性濃縮を開発しました。サンプル。 また、ORF1p 染色が STIC 病変サンプルで強く見られることから、ORF1p の発現が HGSOC の発症の初期事象であることも示します。 さらに、ORF1p は、リスク低減手術による浸潤性疾患のない偶発的 STIC 病変で見つかり、正常な FT 上皮から HGSOC 前駆病変への移行が、進行した HGSOC で保持される ORF1p 発現の獲得によって特徴付けられることが検証されました。 興味深いことに、我々は、DNA脱メチル化剤がFT細胞によるORF1pの発現と放出を引き起こすことを発見し、それによって良性FT細胞におけるORF1p発現を抑制するために必要な機構としてDNAメチル化が実験的に検証された。

この研究の症例は、ブリガム アンド ウィメンズ病院の病理学部門とペンシルバニア大学病院から入手しました。 卵管組織のホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）ブロックは、元の病理報告で HGSOC の存在が示されていた 30 例から切り取られました。 これらの症例のうち、18 例には STIC と診断され、25 例には良性 FT 上皮が認められました。 また、がんやがんのリスクとは関係のない理由でチューブを切除された患者から良性FTの12例と、BRCA1/2変異のリスク低減手術で同定された偶発的STIC（上皮内がんのみ）病変の6例も得た。 これらのヘマトキシリンおよびエオシン (H&E) スライドは 3 人の病理学者 (MSH、LS、RD) によって検査され、深層組織切片に STIC とおそらく浸潤癌が存在することが確認されました。 この研究で使用された血漿サンプルは、マサチューセッツ総合病院のスティーブン スケート博士の保管庫から入手されました。 進行期（III および IV）（補足表 1）乳頭漿液性卵巣癌患者からの 72 個の血漿サンプルと 37 個の対照血漿サンプルを分析しました。

免疫組織化学的染色は、Envision Plus/西洋わさびペルオキシダーゼ システム (DAKO) を使用して実行されました。 FFPE 組織切片を脱パラフィンし、再水和し、過酸化水素溶液中で 30 分間インキュベートして内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックしました。 抗原賦活化は、クエン酸緩衝液 (pH 6.0) 中で 100 °C で 20 分間処理して実行されました。 切片を一次抗体とともに 4 °C で一晩インキュベートしました。 二次抗体を 30 分間適用し、続いて 3,3'-ジアミノベンジジン (DAB) を 5 分間適用しました。 すべての H&E および IHC 画像は、Leica BioSystems (イリノイ州バッファロー グローブ) Aperio CS2 スライド スキャナーで取得されました。

モノクローナル抗 LORF1 抗体 (クローン 4H1; Millipore) を使用して ORF1p 発現を調査しました。 ORF1p 染色は、2 人の婦人科病理学者 (LES および MSH) によって次の 4 段階スケールを使用してスコア化されました: 0 (すべての細胞が陰性)、1 + (散在する稀な細胞 ≤ 10% 陽性細胞)、2 + (局所または多焦点染色 = 10) –75% 陽性細胞）、または 3 +（びまん性染色 ≥ 75% 陽性細胞）。 すべての染色とスコアは 3 人目の病理学者 (RD) によって検査され、2 つのグループに分けられました。スコア 0 および 1+ は「ORF1p 陰性」として定義され、スコア 2+ および 3+ は「ORF1p 陽性」として分類されました。

細胞をカバーガラス上で一晩増殖させた。 細胞を4%パラホルムアルデヒド/PBSを用いて室温で20分間固定した。 細胞を1X PBS中の3% BSAでブロックし、一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートしました。 二次抗体を室温で0.5時間インキュベートしました。 検出は、Alexa 488 Fluor Dyes (Molecular Probes; Thermo Fisher Scientific) に結合した二次抗体を使用して実行されました。 カバースリップは、DAPI 含有培地を使用してスライドガラス上にマウントされました。 細胞は、Nikon E400 顕微鏡を使用した顕微鏡法によって分析されました。

この研究では、8 つの卵巣癌細胞株 (KURAMOCHI、OVCAR-3、OVCAR-4、OVCAR-8、OVKATE、COV318、OVSAHO、および CaOV3) を使用しました。 COV318 および CaOV3 を除くすべての卵巣がん細胞株を、10% ウシ胎児血清 (FBS; Atlanta Biologicals) を補充した RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific) で培養しました。 COV318 および CaOV3 は、10% ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM; Thermo Fisher Scientific) で培養されました。 すべての細胞株は、2022 年にショート タンデム リピート (STR) プロファイリング (IDEXX、ミズーリ州コロンバス) を使用して認証され、Cambrex MycoAlert アッセイ (ペンシルベニア大学ペレルマン医学部細胞センター) を使用してマイコプラズマが含まれていないことが検査されました。 卵管細胞株（FT189、FT194、FT237、FT240、およびFT246）の樹立は以前に記載されています41、42。 FT細胞は、2% Ultroser G血清代替物(Pall Life Sciences)を添加したDMEM/Ham's F-12 1:1(Thermo Fisher Scientific)中で培養した。 初代 HGSOC 細胞 (DF 細胞株) は、以前に記載されているように単離されました 43。 DF細胞は、5%の熱不活化FBSを補充したRenaissance Essential Tumor Medium (RETM; Cellaria Biosciences)中で培養した。 すべての細胞は 37 °C、5% CO2 含有雰囲気で増殖しました (補足表 2 を参照)。

培養FT細胞株を、5μM（DMSO中）の濃度のデシタビン（TOCRIS、カタログ番号2624）またはSGI-110（グアデシタビン）（Adooq Bioscience、カタログ番号A12744）で3、5、または7日間処理しました。 対照として、細胞をビヒクルのみで処理した。

すべての細胞は 80% コンフルエンスまで増殖しました。 次いで、培地を、ＦＢＳ（卵巣癌細胞株）またはＵｌｔｒｏｓｅｒ Ｇ血清代替物（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（ＦＴ細胞株）を含まない培地に交換し、細胞をさらに７２時間培養した。 次いで、馴化培地を遠心分離によって清澄にし、Millipore Amicon Ultra-15遠心分離フィルター(Millipore Sigma)を使用して濃縮した。 ならし培地のタンパク質含有量は、Pierce BCA キット プロトコール (Thermo Fisher Scientific) を使用して定量化し、ウェスタン ボットを下記のように実行しました。

全細胞溶解物は、M-PER バッファー (Thermo Fisher Scientific) を使用して調製しました。 全細胞溶解物のタンパク質含量は、Pierce BCA キット プロトコール (Thermo Fisher Scientific) を使用して定量されました。 タンパク質 (20 ～ 30 μg) を 4 ～ 20% 勾配 SDS-PAGE で分離した後、Turbo Blot システム (Bio-Rad) を使用して PVDF メンブレンに転写しました。 膜を一次抗体とともに 4 °C で一晩インキュベートしました (補足表 3 を参照)。 洗浄後、メンブレンをHRP結合二次抗体とともに室温で1時間インキュベートしました。 タンパク質は、Clarity Chemiluminescent HRP Antibody Detection Reagent (Bio-Rad) を使用して検出し、Chemi-Doc イメージング システム (Bio-Rad) で視覚化しました。 すべての図のトリミングされていないブロットは、補足図にあります。 1～4。

LINE-1 メチル化は、製造元の推奨に従って Global DNA メチル化 - LINE-1 キット (Active Motif、カタログ番号 55017) を使用して評価しました。 LINE-1 キットは、ヒトゲノム DNA 中の 5-メチルシトシン レベルを検出および定量するための ELISA ベースのアッセイです。 簡単に説明すると、前述のように、FT 細胞株をデシタビンまたは DMSO で処理しました。 次に、DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen、カタログ番号 69504) を使用してゲノム DNA (gDNA) を抽出しました。 各サンプルの gDNA 1 μg を、MseI 酵素 (10 U/μL) を用いて 37 °C で一晩消化しました。 消化された gDNA 100 ng をサーマルサイクラーで LINE-1 プローブとハイブリダイズさせました (98 °C で 10 分間、68 °C で 1 時間、その後 25 °C まで急速に昇温)。 LINE-1 プローブは、LINE-1 リピートエレメントの 290 bp 領域にハイブリダイズするように設計された 5' ビオチン化オリゴです。 この領域には 88 個のシトシン残基が含まれており、そのうち 12 個は CpG コンテキスト内にあります。 反応は技術的に三重に調製されました。 PCRサンプルをストレプトアビジンでコーティングしたプレートに移し、穏やかに撹拌しながら室温で1時間インキュベートしました。 次に、1:100 希釈の 5-メチルシトシン モノクローナル抗体を室温で 1 時間インキュベートし、続いて HRP 結合二次抗体を 1 時間インキュベートしました。 展開溶液を添加し、停止溶液を添加するまで3分間インキュベートした。 最後に、プレートを 450 nm で読み取りました。 メチル化および非メチル化 DNA 標準サンプルをデシタビン処理サンプルと並行して調製しました。

卵巣がんまたは対照卵管上皮細胞からの馴化培地を、以前に記載した尿素プロトコルに従ってブタトリプシンで消化しました33。 簡単に説明すると、36 mgの尿素（Sigma-Aldrich）を100 μLの馴化培地に最終濃度6 Mまで添加した。必要に応じて、1 M Tris pH 8.0を用いて溶液のpHを8.0に調整した。 タンパク質を6μLの0.5Mトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)(Bio-Rad)で還元し、37℃で30分間インキュベートした。 サンプルを室温まで冷却し、粉末から新たに調製した12μLの0.5Mヨードアセトアミド(IAA)(Sigma-Aldrich)を添加してアルキル化した後、直射光の非存在下、室温で30分間インキュベートした。 尿素濃度を400μLの0.2M Tris HCl pH 8.1で2M未満に希釈し、2μgのトリプシン(Promega)を添加し(平均1:50 E:S)、サンプルをサーモミキサー(Eppendorf)上で16時間インキュベートした。 37 °C、800 RPM で 1 時間。 16時間後、2μgの新鮮なトリプシンを添加し、37℃および800RPMで2時間インキュベートした。 ２時間後、２０μＬの純粋なギ酸を加えて反応を停止させた（最終ｐＨ＜２．５）。 消化されたサンプルは、真空マニホールド (Waters) に取り付けられた 10 mg Oasis® HLB 抽出カートリッジを使用して個別に脱塩されました。 サンプルをロードする前に、カートリッジを 1 mL の 90% アセトニトリル/0.1% ギ酸で湿らせ、1 mL の 0.1% ギ酸で平衡化しました。 各サンプルをロードした後、カートリッジを 3 mL 0.1% ギ酸で洗浄し、0.3 mL の 40% アセトニトリル/0.1% ギ酸を 2 回添加してペプチドを新しい 1.5 mL ポリチューブに溶出しました。 サンプルは真空遠心分離によって乾燥させ、使用するまで-80℃で乾燥状態で保管しました。

卵巣がん患者から収集した腹水は、以前に説明した尿素プロトコルに従って lys'C とブタトリプシンで消化されました 34。 簡単に説明すると、9 M 尿素 (Sigma-Aldrich) 60 μL を 30 μL の腹水 (BCA による平均タンパク質濃度 33.7 mg/mL) に最終濃度 6 M になるまで加えました。溶液の pH を 8.0 に調整しました。 1 M Tris pH 8.0 が必要です。 タンパク質を6μLの0.5Mトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)(Bio-Rad)で還元し、37℃で30分間インキュベートした。 サンプルを室温まで冷却し、粉末から新たに調製した12μLの0.5Mヨードアセトアミド(IAA)(Sigma-Aldrich)を添加してアルキル化した後、直射光の非存在下、室温で30分間インキュベートした。 尿素濃度を300μLの0.2M Tris HCl pH 8.1で1.5Mに希釈した。 リシルエンドペプチダーゼ (lys-C) (Wako) を 50 mM 酢酸に 0.5 mg/mL の濃度で溶解し、40 μL を各サンプルに添加しました (平均 1:50 E:S)。 サンプルをサーモミキサー (Eppendorf) 上で 37 °C、800 RPM で 2 時間インキュベートしました。 2時間後、10μgのトリプシン(Promega)を添加し(平均1:100 E:S)、サンプルを37℃および800 RPMで16時間インキュベートした。 16時間後、10μgの新鮮なトリプシンを添加し、37℃および800RPMで2時間インキュベートした。 ２０マイクロリットルのニートギ酸を加えて反応を停止させた（ｐＨ＜２．５）。 重ペプチド標準（各 75 fmol）を各消化ウェルに添加し、陽圧マニホールド（Waters）に取り付けられた 30 mg Oasis® HLB 抽出プレート（Waters）を使用してサンプルを脱塩しました。 ウェルを１．５ｍＬの８０％アセトニトリル／０．１％ギ酸で洗浄し、１５ｐｓｉを加えて２ｍＬの０．１％ギ酸で平衡化した。 マルチチャンネルピペットを使用してサンプルを移す前に、さらに 0.2 mL の 0.1% ギ酸を湿ったカートリッジに加えました。 サンプルをロードした後、カートリッジを 3 mL の 0.1% ギ酸で陽圧 (9 psi) で洗浄しました。 洗浄後、消化された血漿ペプチドを２倍量の０．５ｍＬの５０％アセトニトリル／０．１％ギ酸（６ｐｓｉ）で溶出した。 溶出プレートを BioExcell® フィルム (World Wide Medical Products) で覆い、真空遠心分離によって凍結および乾燥させた後、アルミホイルで密封し、使用するまで -80 °C で保管しました。

卵巣がん患者 1 人あたり 40 マイクロリットルの血漿を 96 ディープウェルプレートに 3 回ずつ手動で分注し、前述の自動化に適応した尿素プロトコルを使用して lys-C とトリプシンで消化しました 34。 簡単に説明すると、100μLの9M尿素と25μLの0.25M TCEPを、サンプルを含む96ウェルプレートの対応するウェルごとに、384ウェルプレート（Greiner）の象限1および2に加え（補足図5A）、 Bravo LT ロボット (Agilent) の位置 7 (補足図 6)。 補足図6に示すように、サンプルプレート、試薬プレート、ピペットチップ、および溶媒プレートをBravo LTにロードしました。Bravo LTは、光の浸透を最小限に抑えるためにカスタムの黒いシュラウドで覆われ、Bravo消化プログラムが開始されました。 80 マイクロリットルの 9 M 尿素と 15 μL の 0.25 M トリス(2-カルボキシエチル) ホスフィン (TCEP) (Bio-Rad) を各サンプルに加え、サンプルプレートを温度制御シェーカーの位置 4 に移動しました (補足図 6) ) 37 °C、800 RPM で 30 分間インキュベートしました。 ヨードアセトアミド (IAA) (Sigma-Aldrich) を 0.2 M トリス HCl pH 8.1 に最終濃度 0.5 M になるように溶解し、50 μL を Bravo デッキの 7 の位置にある 384 ウェルプレートの象限 3 に加えました (補足図)。 6)。 30 分間の TCEP タンパク質変性後、Bravo ロボットはサンプル プレートを位置 5 に戻し、20 μL の 0.5 M IAA を各サンプルに加えた後、暗所で混合せずに 30 分間インキュベートしました。 リシルエンドペプチダーゼ（lys-C）（Wako）を50 mM 酢酸に0.5 mg/mLの濃度まで溶解し、100 μLを384ウェルプレート2の象限1に加えました（補足図5B）。 50 mM 酢酸中で 0.5 mg/mL で処方された 100 マイクロリットルのブタ トリプシン (Promega) をプレート 2 の象限 2 に添加し (補足​​図 5B)、Bravo LT の位置 6 に配置しました (補足図 6)。 ３０分間のＩＡＡタンパク質のアルキル化後、３００μＬの０．２Ｍ トリスＨＣｌ ｐＨ８．１および１００μＬのｌｙｓ－Ｃ（Ｅ：Ｓ １：５０）を添加した。 サンプルプレートを手動でオフラインサーモミキサー (VWR) に移し、37 °C、800 RPM で 2 時間インキュベートしました。 lys-C 消化後、サンプルプレートを Bravo デッキの位置 5 に戻し (補足​​図 6)、48 μL のトリプシンを各サンプルウェルに吸引しました (E:S 1:100)。 サンプルプレートを手動でオフラインサーモミキサー (VWR) に移し、37 °C、800 RPM で 2 時間インキュベートしました。 2 時間後、2 回目のトリプシン添加 48 μL をサンプルに吸引しました。 その後、Bravo 法を一時停止し、プレートをプラスチックシールで覆い、オフラインのサーモミキサーで 37 °C、800 RPM で 16 時間インキュベートしました。 16時間後、90μLの10%ギ酸を各サンプルに分注して酵素活性を停止させた(最終濃度1%)。 重ペプチド標準（各150 fmol）を各消化ウェルに添加し、陽圧マニホールド（Waters）に取り付けた30 mg Oasis（登録商標）HLB 抽出プレート（Waters）を使用して脱塩した。 ウェルを１．５ｍＬの８０％アセトニトリル／０．１％ギ酸で洗浄し、１５ｐｓｉを加えて２ｍＬの０．１％ギ酸で平衡化した。 マルチチャンネルピペットを使用してサンプルを移す前に、さらに 0.2 mL の 0.1% ギ酸を湿ったカートリッジに加えました。 サンプルをロードした後、カートリッジを 3 mL の 0.1% ギ酸で陽圧 (9 psi) で洗浄しました。 洗浄後、消化された血漿ペプチドを２倍量の０．５ｍＬの５０％アセトニトリル／０．１％ギ酸（６ｐｓｉ）で溶出した。 溶出プレートを BioExcell® フィルム (World Wide Medical Products) で覆い、真空遠心分離によって凍結および乾燥させた後、アルミホイルで密封し、使用するまで -80 °C で保管しました。

LINE-1 ORF1p/L1RE1 遺伝子産物に固有の 4 つのペプチド (LORF1、Uniprot Q9UN81、LORF1_HUMAN) が抗体生成用の免疫原として選択されました: LTADLSAETLQAR、LSFISEGEIK、LIGVPESDVENGTK、および NEQSLQEIWDYVK。 ウサギポリクローナル抗体は、修正を加えて以前に記載されている標準的な 77 日間プロトコール (New England Peptide) に従って、ニュージーランド白色ウサギで生成されました 35。 簡単に言うと、N末端にシステインを追加してペプチドを85%の純度まで合成し、免疫化のためにKLHに結合させました。 ペプチドを組み合わせて、2 匹のウサギを 70 日間かけて用量を徐々に減らしながら免疫化しました。 最終的な採血の抗血清力価をペプチドELISAにより測定した。 最も力価の高い 2 つのペプチド、LSFISEGEEIK および LIGVPESDVENGTK を、免疫ペプチドと結合した Sulfolink カラム (Thermo Fisher Scientific) を使用したアフィニティークロマトグラフィーによって、最終採血のプールから連続的に精製しました。 つまり、血清は力価が最も低いペプチドを含むカラムに結合しました。 次に、各抗体の収量を最大化するために、後続のより高い力価のペプチドに特異的な抗体を含むと予想されるフロースルーを、次に高い力価のペプチドを含むカラムに結合させた。 抗血清が結合した後、グリシン緩衝液（pH 2.5）で溶出する前に、長時間洗浄（> 100 CV）を使用して潜在的なパッセンジャーペプチドを減少させました。 精製した抗体を 25% グリセロール/1X PBS/0.1% NaN3 で透析し、使用するまで -20 °C で保存しました。

20 マイクログラムの各抗体をプロテイン G 磁気ビーズ (Thermo Fisher Scientific) とともに 4 °C で一晩、ビーズ体積と抗体 μg の比率を 2:1 にしてインキュベートしました。 ビーズを 1X PBS/0.03% CHAPS で洗浄した後、抗体ビーズの半分を、前述のように 20 mM DMP を使用して架橋しました 37。 抗体の捕捉効率とパッセンジャーペプチドの測定は、消化されたコントロール血漿または緩衝液に重ペプチドを添加し、架橋ありまたは架橋なしの抗体を使用して濃縮することによって実行されました（「KingFisher での自動ペプチド免疫親和性濃縮」セクションを参照）。 重ペプチドの抽出イオンクロマトグラムを使用して捕捉効率を比較し、軽ペプチドシグナルの相対量を使用して抗体中のパッセンジャーペプチドの割合を推定しました。 C末端に安定同位体標識リジンを含む対応する「重い」ペプチドを合成し、95%を超えるまで精製し、30%アセトニトリル/0.1%ギ酸で配合し、アミノ酸分析によって定量しました(New England Peptide)。 重いペプチドを、ペプチドの「軽い」（内在性）バージョンと「重い」（標準）バージョンの混合物として LC-MRM-MS で分析し、重いペプチド標準中の未標識ペプチドの相対量を決定しました（「NanoLC-MRM」を参照） -MS分析」セクション)。

100 μL の馴化培地、30 μL 腹水、または 20 μL 血漿からの乾燥消化サンプルを 200 μL 1 × PBS/150 mM Tris pH 8.0/0.03% CHAPS に再懸濁し、室温で軽くボルテックス混合した後、250 μL の培地に移しました。 KingFisher ウェル プレート (ウェル プレート内で直接乾燥させた血漿サンプルを除く)。 ペプチドは、以前に記載されているように、免疫親和性濃縮 (IAE) によって KingFisherTM 磁気ビーズ ハンドラー上の磁気ビーズを使用して抽出されました 33。 簡単に言うと、IAEごとに最適化された量のAb（例えば、0.5μg、1μg、または2μg）を含む抗体の混合物を、タンブル混合（Labquake®（Thermo Fisher））によって1μmプロテインG磁気ビーズ（Thermo Fisher Scientific）上に結合させた。科学的)) 2 μL ビーズ/1 μg 抗体を 4 °C で一晩使用。 抗体ビーズを1×PBS/0.03% CHAPSで2回洗浄し、等量の1×PBS/0.03% CHAPSに再懸濁し、各ウェルに添加した。 プレートをアルミホイル接着剤でシールし、4 °C で一晩穏やかにタンブル混合しました。 インキュベーション後、プレートを、ＰＣＲ磁気ヘッドを備えたＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（商標）磁気ビーズプロセッサ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に移した。 ビーズを２５０μＬの１×ＰＢＳ／０．０３％ＣＨＡＰＳで１．５分間２回、０．１×ＰＢＳ／０．０３％ＣＨＡＰＳで１．５分間１回洗浄した。 洗浄後、ビーズを、50μLの3%アセトニトリル/5%酢酸を含む100μL PCRプレートに移し、結合物質を溶出した。 溶出後、ビーズを、200μLの1X PBS/0.03% CHAPS/0.1% アジ化ナトリウムを含むプレートに収集した。

抗体が豊富なサンプルは、AssayMAP Bravo Reverse Phase S (RPS) カートリッジ 34 を使用して脱塩されました。 96 ウェル Bio-Rad PCR プレート内の抗体ビーズ溶出液を Bravo の位置 6 に配置しました。補足図 6 に概要を示すように、AssayMAP RPS カートリッジと溶媒を Bravo に配置しました。RPS カートリッジは 50 μL 90% アセトニトリル/0.01% でプライミングされました。ギ酸を３００μＬ／分で添加し、２５μＬ／分で０．１％ギ酸５０μＬで平衡化した。 次いで、サンプルを２μＬ／分でカートリッジにロードした。 カートリッジを５０μＬの０．１％ギ酸で２回洗浄し、５０μＬの４０％アセトニトリル／０．０１％ギ酸で５μＬ／分で溶出した。 溶出液を乾燥させ、LC-MRM-MS 分析の前に 3% アセトニトリル/5% 酢酸に再懸濁しました。

馴化培地、腹水および血漿からの抗体が豊富な脱塩サンプルを、Nanospray Flex ソース (Thermo Fisher Scientific) および Easy-nLC 1000 システムを搭載した TSQ Quantiva トリプル四重極質量分析計で分析しました。 イオン源を陽イオンモードに設定し、キャピラリー温度を 300℃、スプレー電圧を 2000、スイープガスを 0 に設定しました。Easy-nLC 1000 システムを移動相 A (3% アセトニトリル/0.1% ギ酸)、移動相 B でプライミングしました。 (90% アセトニトリル/0.1% ギ酸)。 サンプルを、10 μm エミッターに引き上げられ、1.9 μm 200 Å C18-AQ Reprosil ビーズ (Dr.マイシュ）。 ＬＣ勾配は、３分間で５％Ｂ、５０分間で５％Ｂから４０％Ｂ、２．３分で４０％Ｂから９０％Ｂであった。 8 分の RT ウィンドウと 1.5 秒のサイクル時間を使用して、スケジュールされた MRM によってペプチドごとに 3 つの遷移をモニタリングしました。 衝突エネルギーは 4 つのステップにわたって最適化され、バッチあたり遷移数が 500 未満の予定されていない小規模バッチではステップあたり 2.5 V になりました。

すべての遷移イオンの抽出イオンクロマトグラム (XIC) は、Skyline ドキュメント (Skyline バージョン 4.1.0.11796 https://brendanx-uw1.gs.washington.edu/labkey/project/home/software/Skyline/begin.view44) を使用して統合されました。相対的なペプチド存在量は、軽ピーク領域と重ピーク領域の比として報告されました。

統計分析は、GraphPad Prism 8 (GraphPad Software Inc.)を使用して実行されました。 形態学的に正常なFTE、STIC、および侵襲性HGSOCの間のORF1p免疫反応性または複合スコアの差異を、クラスカル・ウォリス検定、続いてグループの多重比較のためのダン検定を使用して調べた。 iMRM 定量化結果の統計分析は、MSstats v3.7.3 を使用して、対応する安定同位体標識標準ペプチドに対する正規化後の各遷移の内因性ペプチドの log2 強度についてペプチド レベルで実行されました。 データは Skyline からエクスポートされ、MSstats が各タンパク質のペプチドごとに iMRM データを個別に分析できるようにカスタム形式に設定されました。 XIC の手動検査によって内因性レベルのペプチドが検出されたかどうかに関係なく、すべてのサンプルのピーク面積が含まれました。

この研究はヘルシンキ宣言に従って実施されました。 この研究は、ブリガム・アンド・ウィメンズ病院（BWH）、マサチューセッツ州ボストンのマサチューセッツ総合病院（MGH）、およびペンシルバニア大学（UPenn）の治験審査委員会によって承認された。 採血のすべてのプロトコールはマサチューセッツ総合病院の治験審査委員会によって承認され、すべての被験者は書面によるインフォームドコンセントを受け取りました。

腫瘍形成組織に対する LINE-1 ORF1p の発現が制限されていることが、卵巣を含むさまざまな癌で示されています。 がん特異的タンパク質は潜在的なバイオマーカーとして機能する可能性があるため、FDA が承認した 2 つの卵巣がんバイオマーカー、HE4 および CA-125 に関連して ORF1p 発現を評価しました。 予想どおり、がん細胞株のみが ORF1p、HE4、および CA-125 を発現しました。 特に、各マーカーが異なる細胞株溶解物全体で独自の発現パターンを示すことが観察されました (図 1A)。 たとえば、ORF1p は COV318 細胞で発現していましたが、これらの細胞は HE4 または CA-125 を発現していませんでした。 同様に、OVSAHO細胞はHE4を独自に発現しましたが、ORF1pまたはCA-125は無視できました（図1A）。 ORF1p の発現は広範囲の卵巣がんサンプルで観察され、HE4 や CA-125 とは独立しているため、ORF1p は卵巣がんのマルチモーダル、マルチバイオマーカー スクリーニング ツールにおいて有用な分析物として機能する可能性があると仮定します。

LINE1 ORF1p は HGSOC の馴化培地で検出可能であり、他の既知のバイオマーカーと相補的です。 (A) 全細胞溶解物。 FT および HGSOC 細胞株における ORF1p、HE4、および CA125 タンパク質発現 (WB)。 分析されたマーカーは、FT 細胞と HGSOC 細胞の間で異なる発現を示します。 ビンキュリンを内部対照として使用した。 (B) FT および HGSOC からの無血清ならし培地における ORF1p タンパク質発現 (WB)。 (C) 全細胞ライセート。 腹水由来の 6 つの初代 HGSOC 細胞 (DF 細胞) における ORF1p タンパク質発現 (WB)。 ビンキュリンを内部対照として使用した。 (D) 無血清ならし培地中の初代 HGSOC 細胞における ORF1p タンパク質発現 (WB)。

バイオマーカーとしての ORF1p の可能性をさらにテストするために、卵巣がん細胞が ORF1p を培地に放出できるかどうかを評価しました。 この目的のために、我々は培養細胞の馴化培地を分析しました。 予想どおり、どの FT 細胞株も ORF1p を放出しませんでした。 反対に、卵巣がん細胞株は、倉持細胞と OVSAHO 細胞 (図 1B) を除いて、容易に検出可能な ORF1p を放出します。これらの細胞株も、全細胞溶解物における ORF1p の発現が低かった (図 1A)。 HGSOC 細胞株で見られる ORF1p の発現と放出が細胞培養のアーチファクトであるかどうかを評価するために、進行性 HGSOC 患者の腹水に由来する原発腫瘍細胞 (DF 細胞株 45) の ORF1p も調べました。 実際、6 つの初代 DF 細胞株すべてが検出可能な ORF1p 発現を示し (図 1C)、調整培地に ORF1p を放出する (図 1D) ことを観察しました。 総合すると、ORF1p の発現はがん細胞に限定されており、細胞培地への ORF1p の遊離は、バイオマーカーとしての可能性を調べるための優れた候補になります。

HGSOC 細胞による ORF1p の放出により、我々は、ORF1p がこの疾患を患う患者の体液中で検出できるかどうかを疑問に思うようになりました。 この可能性に対処するために、我々は、ORF1p を独自に識別する 2 つのペプチドを検出するための免疫多重反応モニタリングとそれに続く質量分析 (iMRM-MS) アッセイを開発しました (「方法」セクションを参照)。

まず、アッセイのパフォーマンスを評価するために、サンプル中に存在する内因性ペプチドシグナルを基準として使用し、標準的な血漿バックグラウンドで応答曲線を作成しました。 LINE-1 ORF1p からの重標識合成ペプチドを、5 amol/μL ～ 50 pmol/μL のレベルで 3 回、消化血漿 10 μL にスパイクしました。 Skyline の Quasar プログラムを使用して応答曲線分析を行い、サンプル内の内因性レベルを 1 fmol/μL と仮定すると、検出限界は血漿中のペプチド LIGVPESDVENGTK については 80 amol/μL、ペプチド LSFISEGEIK については 280 amol/μL でした（補足図） .7AおよびB）。

次に、iMRM-MS がウエスタンブロット分析と同様の ORF1p 相対存在量の読み取り値を提供し、複雑な体液中での測定に適用できるかどうかを評価するために、細胞からの馴化培地のコンパニオンセットにおける iMRM-MS による ORF1p 発現を評価しました。系統と患者の一次文化。 馴化培地では、iMRM-MS の結果はウェスタンブロットで得られたものと非常に類似しており、ORF1p の濃度は COV318 細胞上清で最も高く、健康な FT 細胞培養物からの上清では検出されませんでした (図 2A)。 初代ヒト DF 細胞株からの馴化培地は iMRM-MS によって分析されませんでした。 ただし、これらの細胞株が由来する患者の腹水サンプル中の ORF1p レベルは、6 つのケースすべてで測定および検出されました (図 2B)。 患者間の腹腔内腫瘍量と総腹水量の予想される実質的な差異を考慮すると、ウェスタンブロットとiMRM-MSでそれぞれ測定した初代HGSOC培養物からの上清とペア腹水サンプルの間のORF1pシグナルの相対強度には驚くべき程度の一致があった。 (図1D、2B)。 ただし、DF106 のシグナルは著しく異なり、iMRM-MS で測定した場合、DF106 では ORF1p が他の腹水サンプルよりも一桁高かったのに対し (図 2B)、そのレベルは一次腹水サンプルで測定した場合には分布の下端にありました。ウェスタンブロットによる細胞株上清（図 1D）。 それにもかかわらず、データは、体液中のORF1pレベルがiMRM-MSによって検出可能であることを示唆しているが、DF106の結果は、追加の要因が複雑な生体マトリックス中のORF1pの測定された存在量に影響を与える可能性があることを強調している。

LINE-1 ORF1p は、HGSOC 患者の馴化培地、腹水および血漿中の iMRM-MS によって検出されます。 (A) FT および HGSOC 細胞株の上清、および (B) 患者の腹水からの初代 HGSOC 細胞を iMRM-MS によって分析しました。 単一の最良遷移における軽ペプチドと重ペプチドのピーク面積比 (PAR) を、各サンプルのタンパク質の量に正規化しました。 各サンプルの PAR は、最も高い値を持つサンプルに対して正規化され、各ペプチドのパーセンテージとして報告されました。 (C) 72 例の HGSOC と 37 人の健康な対照を含む独立したコホートの健康なサンプルと病気のサンプルの間の相対的な検出と差異を示す軽ペプチドと重ペプチドのピーク面積比 (N = 合計患者血漿サンプル 109)。

さらに iMRM-MS を使用して、（代用として機能する）細胞株馴化培地からのサンプルのコンパニオンセットを評価することにより、シグナル源 (STIC または HGSOC 細胞)、腹水、末梢循環などのサンプルタイプ全体で ORF1p を評価しました。腫瘍周囲濃度の場合）、および主に進行期の HGSOC を持つ患者からの腹水または血漿（補足図 7C–E）（方法および補足表 3）。 予想通り、ORF1p ペプチド MS シグナルの量はバックグラウンド マトリックスの濃度と逆相関していました。 ペプチドの抗体濃縮とそれに続く標的 MS を使用すると、細胞ならし培地よりもシグナル強度が 30 分の 1 低いにもかかわらず (2500 対 75,000 cps)、血漿サンプルの約 10% に含まれる ORF1p ペプチドの少なくとも 1 つである LSFISEGEIK が確実に同定されました (補足図 7E 対 7C)。 発生源から循環までのシグナルの希釈が中心的な要因であると考えられますが、ORF1p ペプチドの濃度は抗体濃縮後も低いままであり、これはおそらく内因性の存在量がはるかに多い非特異的または低親和性結合ペプチドによるシグナル抑制によるものと考えられます。

追加の実験を行って、検出されたシグナル (2500 cps) が血漿中の内在性タンパク質に由来するものなのか、それとも重ペプチド 38 の不完全な同位体標識または抗体内のパッセンジャーペプチド (ポリクローナル抗体に結合したペプチド) のいずれかによる技術的アーチファクトを表しているのかを確認しました。抗体生成およびアフィニティー精製プロセス;「方法」セクションを参照)35。 補足の図8Aに示すように、重ペプチドのサンプルで観察された光シグナルの強度は非常に低く、300 cps未満であり、検出可能なシグナルについては、遷移の比率は重標準の比率と一致しませんでした。 軽いペプチドのシグナル強度は、緩衝液および対照血漿中の抗体濃縮によっても低いままで変化せず、すべての場合において、重いペプチドの遷移比と一致しない遷移比を有した。 したがって、外因性ペプチドによるアーチファクトを裏付ける証拠はありませんでした。 患者の血漿では、ORF1pの軽ピーク：重ピークの面積比は、一般に定量化可能な比（0.007）と考えられている値を下回っていましたが、対照試験サンプルのシグナルよりも明らかに大きかった（補足図8B）。

最後に、MSstats で提供される統計フレームワークを使用して、72 人の癌患者と 37 人の健康な患者を含む 109 人の患者サンプルのコホートに対して、iMRM-MS アッセイを 3 日に分けて 1 回ずつ実行しました (「方法」セクションを参照) 46。 図 2C に示すように、倍率変化 (log2 = 0.035) は統計的に有意ではありませんでしたが、HGSOC サンプルでは対照と比較して ORF1p 濃度が高くなる傾向がありました。

まとめると、これらの結果は、ORF1p が HGSOC 患者の血流中で確実に検出できることを示しています。 それにもかかわらず、血漿診断バイオマーカーとしてのORF1pの性能のより正確な定量的推定値を提供するには、アッセイの定量限界のさらなる改善とより大きな試験集団が必要とされるであろう。

ORF1p が HGSOC 細胞によって発現され、体液中で検出可能であるという観察により、ORF1p の発現が HGSOC 腫瘍形成の初期事象であるか後期事象であるかを調査するようになりました。 免疫組織化学 (IHC) を利用して、HGSOC と診断された 30 人の患者と 12 人の健康な対照からの組織標本における ORF1p 発現を評価しました。 p53 および Ki-67 染色を実行して、それぞれ癌細胞と増殖細胞を同定しました (図 3A)。 HGSOC の症例では、18 の標本で 1 つ以上の STIC が特定されましたが、隣接する形態学的に正常な FTE が 25 の症例で存在しました。 正常なFT上皮はORF1p発現に関して陰性であったが、HGSOCはほとんどすべての場合においてびまん性陽性であった(図3A、表1)。 FT 上皮における発現の欠如は、STIC または HGSOC の有無にかかわらず観察され、正常な良性 FT 上皮が ORF1p に対して陰性であることを示唆しています。 HGSOC における発現は一般に強力で拡散しており (図 3A、B)、細胞質または全細胞に分布していました (図 3B)。 興味深いことに、IHC スコアを陰性 (0 と 1) 群と陽性 (2 と 3) 群に二分すると、STIC 病変の発現は強く、14/18 例が陽性を示しました (図 3A、表 1)。

LINE-1 ORF1p の発現は、漿液性卵巣癌の腫瘍形成の初期イベントです。 (A) 形態学的に良性の卵管上皮 (FTE)、漿液性卵管上皮内癌 (STIC)、および浸潤性高悪性度漿液性卵巣癌 (HGSOC) の組織における LINE-1 ORF1p 発現 (IHC)。 STIC 病変および HGSOC では豊富な ORF1p が発現しますが、正常な FTE は陰性です。 p53 染色は癌細胞を識別し、Ki-67 は STIC および浸潤性腫瘍の増殖細胞を識別します。 すべての顕微鏡写真（対物レンズ 20 倍）は、病変の位置を揃えるために 1 つの代表的な症例から撮影されました。 (B) HGSOC における ORF1p の細胞分布。 細胞質および膜の染色パターンを示す 2 つの代表的なケースを示します (対物レンズ 40 倍)。

FT 前駆体と HGSOC に関する最近のゲノム研究では、進行性 HGSOC の場合、FT 内に STIC と思われるものの存在が、実際には前駆体を装った転移性疾患である可能性があることが示されています47、48、49、50。 この可能性に対処するために、我々はリスク低減手術による偶発的 STIC 病変の 6 例を ORF1p 発現に関して染色した。 このような場合、浸潤性疾患はありません。 ORF1p 発現は 6 例中 4 例で検出されました。 HGSOCの場合と同様、ORF1pの発現は悪性STIC細胞では強かったが、隣接する正常なFT上皮では強かった（図4）。 これらの結果は、ORF1p 発現が HGSOC の FT 前駆体で起こることを確認します。

LINE-1 ORF1p は偶発的な STIC 病変で発現します。 卵管上皮（FTE）および漿液性卵管上皮内癌（STIC）病変（IHC）におけるヘマトキシリン・エオシン（H&E）染色、p53、およびLINE-1 ORF1p発現の代表的な画像。 偶発的な STIC 病変は、強い細胞質および全細胞性の ORF1p 発現を示します (20 倍)。 隣接する良性上皮には ORF1p の発現はありません。 強い核 p53 染色は STIC 病変の特徴であり、正常組織では陰性です。 挿入顕微鏡写真 (40 倍) は、良性 FTE の正常な繊毛細胞と STIC 病変の悪性細胞を強調しています。

正常な体細胞では、DNA メチル化および関連機構が LINE-1 レトロトランスポゾンの発現を阻害することが十分に証明されています。 しかし、腫瘍細胞では一般に DNA が低メチル化されており、卵巣などのさまざまながんで観察される LINE-1 発現の増加につながります 26,51,52。 DNA 脱メチル化が非腫瘍原性 FT 細胞で LINE-1 の発現と放出を誘導できるかどうかを評価するために、4 つの異なる FT 細胞株を DNA メチルトランスフェラーゼ阻害剤 (DNMTi) デシタビン (5 μM) で 3、5、または 7 日間処理しました。 予想通り、デシタビン処理により、FT細胞株においてDNMT1Aが枯渇し(図5A)、LINE-1メチル化が減少しました(図5B)。 ORF1pに関しては、4つのFT株すべてが処理後に強いORF1p発現を示しましたが、DMSO単独では効果がありませんでした（図5C）。 さらに、我々は第 2 世代の DNMTi、SGI-110 (グアデシタビン) をテストしました。これは、シチジン デアミナーゼによる分解に耐性があり、活性代謝産物であるデシタビンへの細胞の曝露を延長するように合理的に設計されており、迅速な DNA へのより多くの取り込みを保証します。分裂細胞53,54。 我々の以前の結果と一致して、5μM SGI-110での処理は、処理後3日という早い時点でORF1pの強力な発現をもたらした(図5D)。 5 または 7 日間の長期治療により ORF1p 発現がさらに増強されましたが、DMSO は効果がありませんでした (図 5D)。 免疫蛍光顕微鏡法により、デシタビン処理されたFT細胞と未処理のFT細胞におけるORF1pの発現が確認されました。 HGSOCにおけるORF1pの細胞内局在と一致して、ORF1pは主にDNMTi処理FT細胞の細胞質で見出された（図5E）。

卵管細胞における DNA メチル化の喪失により、LINE-1 ORF1p の発現と馴化培地での検出が引き起こされます。 FT 細胞株を DNMT 阻害剤のデシタビンまたは SGI-110 (5 μM) で 3、5、または 7 日間処理しました。 DMSOをネガティブコントロールとして使用しました。 (A) デシタビン治療後の DNMT1A タンパク質発現 (WB) および (B) LINE-1 メチル化レベル。 ゲノム DNA 中の LINE-1 の 5-メチルシトシン レベルを定量化し、光学密度 (OD) を 450 nm で測定しました。 DNMT1A レベルと LINE-1 メチル化の有意な減少 (N = 3. ***p < 0.0002) が観察されました。 (C) デシタビン処理後の FT 細胞における ORF1p タンパク質発現 (WB)。 処理前にORF1pを発現する系統はなかったが、処理の5日後にはORF1pがすべての系統で豊富に発現した。 β-アクチンはローディングコントロールとして機能します。 (D) WBによるデシタビンまたはSGI-110処理後のFT細胞におけるLINE-1 ORF1p発現の比較。 どちらの化合物も同様に、早ければ 3 日で ORF1p 発現を誘導できます。 (E) デシタビンまたは SGI-110 で処理した FT 細胞を、ORF1p の存在について免疫蛍光法で検査しました (10 倍の対物レンズ)。 (F) 脱メチル化剤で処理した後の FT 細胞の馴化培地における ORF1p タンパク質発現 (WB)。 COV318 を ORF1p 放出のポジティブコントロールとして使用しました。

最後に、デシタビンまたは SGI-110 による FT 細胞の処理が ORF1p の放出を促進するかどうかを尋ねました。 この目的のために、FT 細胞を DMSO、デシタビン、または SGI-110 で 5 日間処理し、それらの馴化培地を分析しました。 我々の細胞株データと一致して、DNMTisによるFT細胞の処理はORF1p分泌を引き起こした(図5F)。 まとめると、これらのデータは、DNA メチル化が FT 細胞における LINE-1 発現と ORF1p 放出を抑制するために必要な機構であることを示しています。

ヒトゲノムには、転移因子の活性を反映する反復要素が散在しています。 LINE-1 はそのようなシーケンスです。 自己増殖し、タンパク質をコードする、ヒトで活性な移動性遺伝要素 19,51,55。 LINE-1 配列は、遺伝性構造変異の重要な原因であるだけでなく、がんゲノムへの後天的な挿入を引き起こす可能性もあります 19。 今回我々は、高悪性度漿液性卵巣がんにおけるLINE-1のタンパク質コード産物の1つであるORF1pの発現について報告する。 私たちはさまざまなアプローチを使用して、3 つの主要な観察を行っています。 まず、ORF1p が腫瘍細胞および原発性腹水由来 HGSOC 細胞株によって発現および放出され、iMRM-MS を使用して卵巣がん患者の腹水および血漿を含む体液中で確実に検出できることを示します。 第二に、ORF1p の発現は FT 前駆体、特に偶発的な STIC 病変で発現されるため、HGSOC 発生の初期事象であることを示します。 最後に、我々は、DNA 脱メチル化が不死化 FT 上皮細胞における ORF1p 発現を活性化できることを示し、これは DNA メチル化がこれらの良性細胞における LINE-1 発現を抑制するために必要な機構として機能することと一致している。

腎臓癌、食道癌、膵臓癌、肺癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌などの広範囲の癌が LINE-1 ORF1p を発現することが報告されています 26、27、29、56、57。 今回我々は、卵巣がん細胞が ORF1p を発現するだけでなく放出することを報告し、これは臨床バイオマーカー開発の観点から非常に関連性の高いものであると報告する。 これに関連して、我々は、HGSOC組織サンプルの組織間質液中に見出されるプロテオタイプのORF1pペプチドを検出するための免疫MRM-MSアッセイを開発した（Gillette et al.、原稿準備中）。 このアプローチにはいくつかの重要な特徴があるため、iMRM-MS アッセイを使用しました。(1) 効率的なサンプル処理によるバイオマーカー候補の高レベルの多重化をサポートするフォーマットを使用したタンパク質の測定。 (2) アフィニティー試薬 (抗ペプチド抗体) の使用により、プロテオタイプのペプチド標的の相対存在量が増加し、臨床で一般的に収集および測定される複雑な生体液 (血漿など) におけるそれらの検出の分析感度が向上します。 (3) 二次抗体の代わりに質量分析を使用すると配列特異性が得られ、測定が目的の分析物に由来することが保証されます 34。

iMRM-MS アッセイでは、市販細胞株と初代細胞株の両方の上清におけるウェスタンブロットの結果がほぼ再現されました。 注目すべきことに、iMRM-MS は、HGSOC 患者の女性における CA-125 レベルが卵巣嚢胞液から腹水および血漿に移行することについて説明されているのと同様に、腫瘍周囲サンプルから腹水、血漿へと信号源からの距離が増加するにつれて信号勾配が減少することを示しました58。 。 初代細胞株上清とそれらに対応する腹水サンプル中の相対的な ORF1p レベル間の一般的な対応関係は、レベルの差がアクセス可能な体液中での診断バイオマーカーとして機能する可能性があることを示唆していますが、適切に検査できるのは多数の HGSOC 患者血漿サンプルと適切な対照における系統的な検査のみです。この仮説。

設定された両方のペプチドアッセイの iMRM-MS 結果は相関性が高く、どちらも上清では良好に機能しましたが、LSFISEGEEIK アッセイのみが患者の血漿サンプルで内因性 ORF1p を検出しました。 免疫親和性が最も高く血漿タンパク質が除去された血漿から追加のサンプルを iMRM-MS で分析すると (データは示されていません)、ORF1p が検出されたサンプルの相対数は 3 倍の約 30% に増加しました。 これらの進歩にも関わらず、血漿中での検出は自信を持って主張できますが、ORF1p シグナルの絶対強度が低く、それに対応する低い光：重ピークの面積比により、これらのサンプルでは正確な定量が不可能になります。 さらに、ORF1p シグナルが検出されたサンプルでは、​​ORF1p シグナルがノイズをわずかに上回っているだけであるため、ORF1p が検出されなかったサンプルについて強い主張をすることはできません。 これらの限界にもかかわらず、我々の結果は卵巣がんバイオマーカーとしてのORF1pの実用化の可能性を成熟させることに確かに貢献し、血漿バイオマーカー研究のためのさらに高感度なアッセイの必要性を強調している。

体液中の LINE-1 の定量化は、がんバイオマーカーとしての可能性を強調しており、これまでの多くの出版物で研究されてきました。 LINE-1 DNA に関しては、乳がん患者の血清中の循環 DNA における LINE-1 の qPCR による評価は、早期乳がんの検出に有用であることが示されています 59。 LINE-1 DNA メチル化に関しては、無細胞 DNA (cfDNA) を使用した研究により、黒色腫血清サンプルの非メチル化 LINE-1 レベルが健康なドナー血清よりも有意に高いことが示されました 60。 同様に、血漿 cfDNA の LINE-1 低メチル化は、結腸直腸癌の疾患進行バイオマーカーとして提案されました 61。 最近、デジタル ELISA と液滴マイクロフルイディクス (ddELISA) を使用して、乳がん患者の血清サンプル中の ORF1p を検出する研究がありました。 このアプローチは、現在の超高感度タンパク質検出のゴールドスタンダードよりも感度が高かった62。 私たちの発見とこれまでの発見を総合すると、卵巣がんのマーカーとしての LINE-1 と ORF1p の研究と開発が促進されます。

LINE-1 エレメントが活性化される腫瘍性形質転換の段階は明確には理解されていません。 最近の報告 30,31 では、LINE-1 発現に対する正常な抑制が腫瘍発生の初期段階で失われることが示唆されています。 ORF1pは良性FT上皮では陰性であるが、初期の非浸潤性ヒトHGSOC前駆体病変（STIC）には存在し、HGSOCの進行全体を通じて維持されることが観察されたため、我々の結果はこれらの所見と一致している。 重要なことに、偶発的 STIC 病変における ORF1p 発現の評価は、その発現が転移性疾患ではなく早期疾患の症状であることを独自に示しています。

LINE-1 エレメントの DNA メチル化は、正常な成人組織における主要な抑制機構として想定されています。 これに関して、我々は、DNA 脱メチル化剤が FT 細胞株で ORF1p の発現と放出を誘導できるかどうかをテストしました。 複製中に、デシタビンは DNA に取り込まれ、そこで DNMT 酵素を共有結合的にトラップし、DNA とタンパク質の付加物 63 を生成し、続いて DNMT を分解します 64。 私たちのデータは、DNMT 阻害剤であるデシタビンと SGI-110 による FT 細胞の処理が、ORF1p の発現と馴化培地への放出を引き起こすのに十分であることを示しました。

p53 は、ヒト体細胞における LINE-1 の発現と活性の重要な抑制因子であると考えられていますが 57,65、我々のデータは、p53 欠損だけでは LINE-1 の抑制解除と ORF1p 発現を引き起こさないことを示唆しています。 この研究で使用された FT 細胞株は、p53 経路を破壊することによって不死化されました 41,42。FT189 および FT194 はヒトテロメラーゼ逆転写酵素 (hTERT) および SV40 T 抗原を使用して不死化されましたが、FT237 および FT240 はウイルス腫瘍タンパク質なしで不死化され、これらはいずれも不死化されませんでした。線はORF1pを表します。 さらに、我々や他の研究者らは、p53 シグネチャとして知られる TP53 変異を有する初期の卵管病変における ORF1p 発現を検出しておらず、さらなる調節機構の関与を示唆している。

要約すると、ORF1p は、卵管細胞と比較して、卵巣がん細胞によって独特に発現されるようです。 偶発的 STIC 病変における ORF1p の存在は、その発現が腫瘍形成の初期事象であることを示しています。 ORF1p の見かけの二成分発現は、腫瘍性形質転換中に失われ、体液中への ORF1p の放出に寄与する DNA メチル化によって調節されます。 より高感度なアッセイが必要であるが、患者血漿からの体液中の ORF1p が確実に検出されたことは、卵巣がんの候補バイオマーカーとしての ORF1p のさらなる開発を裏付けるものである。

リソースおよび試薬に関するさらなる情報およびリクエストは、主任担当者の Ronny Drapkin 博士 ([email protected]) までお送りください。 この研究により、新しい LINE-1 ORF1p ペプチド抗体が生成されました。

Zheng、L.ら。 1990 年から 2017 年の世界、地域、国家レベルでの卵巣がんの発生率と死亡率。 ギネコル。 オンコル。 159、239–247 (2020)。

記事 Google Scholar

Sung, H. et al. 2020 年の世界がん統計: GLOBOCAN は、185 か国の 36 のがんについて、世界中での罹患率と死亡率を推定しています。 CA Cancer J. Clin. 71、209–249 (2021)。

記事 Google Scholar

Siegel, RL、Miller, KD、Fuchs, HE & Jemal, A. がん統計、2022 年。カリフォルニア州がん J. Clin。 72、7–33 (2022)。

記事 Google Scholar

Kurman、RJ、Carcangiu、ML、Young、RH、Simon Herrington、C。女性生殖器の腫瘍の WHO 分類。 (国際がん研究機関、2014)。

バスト、RC Jr. 他卵巣がんの早期発見のためのバイオマーカーと戦略。 がんエピデミオール。 バイオマーカー 29、2504–2512 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

Kroeger, PT Jr. & Drapkin, R. 卵巣がんの病因と不均一性。 カー。 意見。 オブステット。 ギネコル。 29、26–34 (2017)。

記事 Google Scholar

ファン・ナーゲル、JR Jr. 他卵巣がんのリスクがある無症状の女性における経膣超音波スクリーニングの有効性。 ギネコル。 オンコル。 77、350–356 (2000)。

記事 Google Scholar

van NagellHoff、JRJT Jr. 卵巣がんスクリーニングにおける経膣超音波検査：現在の展望。 内部。 J. Women Health 6、25–33 (2013)。

記事 Google Scholar

ハン、C.ら。 高悪性度漿液性卵巣癌の早期検出のための新しい複数のバイオマーカー パネル。 ギネコル。 オンコル。 149、585–591 (2018)。

記事 CAS Google Scholar

ドラプキン、R.ら。 ヒト精巣上体タンパク質 4 (HE4) は、漿液性および類内膜卵巣がんによって過剰発現される分泌糖タンパク質です。 がん研究所 65、2162–2169 (2005)。

記事 CAS Google Scholar

ヘルストロム、I. et al. HE4 (WFDC2) タンパク質は、卵巣癌のバイオマーカーです。 がん研究所 63、3695–3700 (2003)。

Google スカラー

ムーア、RG et al. 良性の婦人科疾患を持つ女性では、血清 HE4 レベルが CA125 よりも上昇する頻度は低くなります。 午前。 J.オブステット。 ギネコル。 206(351)、e1-8 (2012)。

Google スカラー

ハフ、CDら。 遺伝子発現の大規模連続解析により、卵巣がんにおいて差次的に発現される遺伝子が明らかになりました。 がん研究所 60、6281–6287 (2000)。

CAS Google スカラー

ササロリ D.、クーコス G.、ショラー N. CA125 を超えて: 卵巣がんバイオマーカーの時代の到来: もうそこまで来ていますか? バイオマーク。 医学。 3、275–288 (2009)。

記事 CAS Google Scholar

ジェイコブス、IJら。 英国卵巣がんスクリーニング共同試験 (UKCTOCS) における卵巣がんスクリーニングと死亡率: ランダム化対照試験。 ランセット 387、945–956 (2016)。

記事 Google Scholar

メノン、Ｕ．ら。 英国卵巣がんスクリーニング共同試験 (UKCTOCS) における長期追跡調査後の卵巣がん集団スクリーニングと死亡率: ランダム化比較試験。 ランセット 397、2182–2193 (2021)。

記事 Google Scholar

SA ナロッド 卵巣がん検査に未来はあるのでしょうか? JAMAインターン。 医学。 178、611–612 (2018)。

記事 Google Scholar

浦、B.ら。 婦人科腫瘍の間質液とその臨床応用の可能性。 内部。 Ｊ．Ｍｏｌ． 科学。 19、4018 (2018)。

記事 Google Scholar

Burns、KH 癌における転移性要素。 ナット。 Rev. Cancer 17、415–424 (2017)。

記事 CAS Google Scholar

Cordaux, R. & Batzer, MA ヒトゲノム進化に対するレトロトランスポゾンの影響。 ナット。 ジュネ牧師。 10、691–703 (2009)。

記事 CAS Google Scholar

オスタータグ、EM & カザジアン、HH Jr. 哺乳類の L1 レトロトランスポゾンの生物学。 アンヌ。 神父牧師ジュネット。 35、501–538 (2001)。

記事 CAS Google Scholar

ランダー、ES et al. ヒトゲノムの初期配列決定と分析。 Nature 409、860–921 (2001)。

記事 ADS CAS Google Scholar

Hancks, DC & Kazazian, HH Jr. 活性ヒトレトロトランスポゾン: 変異と疾患。 カー。 意見。 ジュネット。 開発者 22、191–203 (2012)。

記事 CAS Google Scholar

Belancio, VP、Roy-Engel, AM、Pochampally, RR & Deininger, P. ヒト組織における LINE-1 エレメントの体細胞発現。 核酸研究所 38、3909–3922 (2010)。

記事 CAS Google Scholar

Pattamadilok, J. et al. 上皮性卵巣癌の潜在的な予後因子としての LINE-1 低メチル化レベル。 内部。 Ｊ．Ｇｙｎｅｃｏｌ． Cancer 18、711–717 (2008)。

記事 CAS Google Scholar

エイカーズ、SN et al. 上皮性卵巣がん患者の腫瘍および白血球における LINE1 および Alu 反復要素 DNA のメチル化。 ギネコル。 オンコル。 132、462–467 (2014)。

記事 CAS Google Scholar

Xia、Z.ら。 子宮内膜症関連卵巣癌における LINE-1 レトロトランスポゾン媒介 DNA 形質導入。 ギネコル。 オンコル。 147、642–647 (2017)。

記事 CAS Google Scholar

Ardeljan, D.、Taylor, MS、Ting, DT & Burns, KH ヒトの長く散在するエレメント 1 レトロトランスポゾン: 新形成の新興バイオマーカー。 クリン。 化学。 63、816–822 (2017)。

記事 CAS Google Scholar

ロディッチ、N. 他長く散在するエレメント 1 タンパク質の発現は、多くのヒトの癌の特徴です。 午前。 Ｊ．パソール。 184、1280–1286 (2014)。

記事 Google Scholar

ピサニック、TR 2位。 他。 長く点在する核エレメント 1 レトロトランスポゾンは、卵巣がん前駆病変の発生中に調節が解除されます。 午前。 Ｊ．パソール。 189、513–520 (2019)。

記事 CAS Google Scholar

Xia、Z.ら。 婦人科癌における L1 レトロトランスポゾン オープン リーディング フレーム タンパク質 1 の発現。 ハム。 パソル。 92、39–47 (2019)。

記事 CAS Google Scholar

Ardeljan, D. et al. LINE-1 ORF2p の発現は、ヒトの癌ではほとんど感知されません。 モブ。 DNA 11、1 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

Kuhn、E. et al. 血漿中のタンパク質を定量するための多重反応モニタリング質量分析と組み合わせた、自動化された多重ペプチド免疫親和性濃縮の研究室間評価。 モル。 細胞。 プロテオム。 11、M1110.13854 (2012)。

記事 Google Scholar

イッポリティ、PJ et al. 自動マイクロクロマトグラフィーにより、ターゲット MS ベースのアッセイで 150 を超えるペプチドの免疫親和性濃縮を多重化できます。 アナル。 化学。 88、7548–7555 (2016)。

記事 CAS Google Scholar

ホワイトエーカー、JR 他。 ペプチド親和性ベースの質量分析法を使用した大規模定量プロテオミクスアッセイ開発の評価。 モル。 細胞プロテオム。 10、M110.005645 (2011)。

記事 Google Scholar

Rifai, N.、Gillette, MA & Carr, SA タンパク質バイオマーカーの発見と検証: 臨床的有用性までの長くて不確実な道のり。 ナット。 バイオテクノロジー。 24、971–983 (2006)。

記事 CAS Google Scholar

Kuhn、E. et al. ペプチド免疫親和性濃縮および標的質量分析による、血漿中のトロポニン I およびインターロイキン 33 の多重アッセイの開発。 クリン。 化学。 55、1108–1117 (2009)。

記事 CAS Google Scholar

Keshishian, H.、Addona, T.、Burgess, M.、Kuhn, E. & Carr, SA 標的質量分析法と安定同位体希釈による、血漿中の低存在量タンパク質の定量的多重アッセイ。 モル。 細胞。 プロテオム。 6、2212–2229 (2007)。

記事 CAS Google Scholar

Gillette, MA & Carr, SA 標的質量分析法による生物医学におけるペプチドとタンパク質の定量分析。 ナット。 方法 10、28 ～ 34 (2013)。

記事 CAS Google Scholar

アンダーソン、NL et al. 安定同位体標準を使用したペプチドおよびタンパク質の質量分析定量と、抗ペプチド抗体 (SISCAPA) による捕捉。 Ｊ．プロテオームＲｅｓ． 3、235–244 (2004)。

記事 CAS Google Scholar

Karst, AM、Levanon, K. & Drapkin, R. 卵管からの高悪性度漿液性卵巣発がんのモデル化。 手順国立アカド。 科学。 USA 108、7547–7552 (2011)。

記事 ADS CAS Google Scholar

Karst, AM および Drapkin, R. ヒト卵管分泌上皮細胞の初代培養と不死化。 ナット。 プロトック。 7、1755–1764 (2012)。

記事 CAS Google Scholar

Davidowitz、RA 他。 間葉系遺伝子プログラムを発現する卵巣がんスフェロイドは、中皮クリアランスの増強を示します。 Ｊ．クリン． 投資する。 124、2611–2625 (2014)。

記事 CAS Google Scholar

Broudy, D. et al. Skyline にインストール可能な外部ツールのフレームワーク。 バイオインフォマティクス 30、2521–2523 (2014)。

記事 CAS Google Scholar

リュー、JFら。 新規治療薬の前臨床評価のための上皮性卵巣癌の患者由来腫瘍異種移植モデルの確立。 クリン。 がん研究所 23、1263–1273 (2017)。

記事 ADS CAS Google Scholar

Choi, M. et al. MSstats: 定量的質量分析ベースのプロテオミクス実験の統計分析のための R パッケージ。 バイオインフォマティクス 30、2524–2526 (2014)。

記事 CAS Google Scholar

マクダニエル、AS et al. 卵管上皮内癌の次世代シーケンス。 JAMAオンコル。 1、1128–1132 (2015)。

記事 Google Scholar

マサチューセッツ州エッカートら。 卵巣がん進行のゲノミクスにより、卵管への上皮内転移を含む多様な転移軌跡が明らかになります。 がんの発見。 6、1342–1351 (2016)。

記事 CAS Google Scholar

ラビディ・ガリー、SIら。 高悪性度漿液性卵巣癌は卵管に発生します。 ナット。 共通。 8, 1093 (2017)。

記事 ADS Google Scholar

ウー、R.-C. 他。 卵巣がん前駆病変のゲノムの状況と進化の軌跡。 Ｊ．パソール。 248、41–50 (2019)。

記事 Google Scholar

グエン、THM 他。 卵巣腫瘍細胞の進化における L1 レトロトランスポゾンの不均一性。 Cell Rep. 23、3730–3740 (2018)。

記事 CAS Google Scholar

Zhang、W.ら。 上皮性卵巣癌における全体的な DNA 低メチル化: 受動的脱メチル化とゲノム不安定性との関連。 Cancers 12、764 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

グリフィス、EA 他。 SGI-110: DNA メチルトランスフェラーゼ阻害剤腫瘍溶解性。 Drugs Future 38、535–543 (2013)。

CAS Google スカラー

ユ・CBほかオリゴデオキシヌクレオチドを使用した細胞への 5-アザ-2'-デオキシシチジンの送達。 がん研究所 67、6400–6408 (2007)。

記事 CAS Google Scholar

Tang、Z.ら。 ヒトトランスポゾン挿入プロファイリング: 卵巣がんにおける体細胞 LINE-1 挿入の分析、視覚化、および同定。 手順国立アカド。 科学。 USA 114、E733 ～ E740 (2017)。

記事 CAS Google Scholar

ロディッチ、N. 他膵管腺癌のクローン進化におけるレトロトランスポゾン挿入。 ナット。 医学。 21、1060–1064 (2015)。

記事 Google Scholar

Doucet-O'Hare、TT et al. バレット食道および食道癌における LINE-1 の発現とレトロトランスポジション。 手順国立アカド。 科学。 USA 112、4894–4900 (2015)。

Google スカラー

Sedlaczek、P. et al. 卵巣癌患者の血清、嚢胞、腹水中の CA125、組織ポリペプチド特異抗原、および可溶性インターロイキン 2 受容体アルファ レベルの比較分析。 Cancer 95、1886–1893 (2002)。

記事 Google Scholar

Sunami, E.、Vu, A.-T.、Nguyen, SL、Giuliano, AE & Hoon, DSB 乳がんの分子バイオマーカーとしての循環 DNA 中の LINE1 の定量化。 アン。 ニューヨークアカデミー。 科学。 1137、171–174 (2008)。

記事 ADS CAS Google Scholar

星本 晋 ほか腫瘍および血清における AIM1 および LINE-1 のエピジェネティックな異常は、黒色腫の進行および疾患の転帰に関連します。 J.インベスト。 ダーマトール。 132、1689–1697 (2012)。

記事 CAS Google Scholar

永井裕也ほか結腸直腸癌のバイオマーカーとしての、血漿中の循環セルフリー DNA の LINE-1 低メチル化状態。 オンコターゲット 8、11906–11916 (2017)。

記事 Google Scholar

コーエン、L.ら。 液滴デジタル酵素結合免疫吸着アッセイを使用した、アトモル感度による単一分子タンパク質の検出。 ACS Nano 14、9491–9501 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

Maes, K. et al. 多発性骨髄腫におけるデシタビン媒介アポトーシスにおける DNA 損傷と修復の役割。 オンコターゲット 5、3115–3129 (2014)。

記事 Google Scholar

Stresemann, C. & Lyko, F. DNA メチルトランスフェラーゼ阻害剤アザシチジンおよびデシタビンの作用機序。 内部。 J. Cancer 123、8–13 (2008)。

記事 CAS Google Scholar

ティワリ、B.ら。 p53 はヒト LINE1 トランスポゾンを直接抑制します。 遺伝子開発 34、1439–1451 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

リファレンスをダウンロードする

有意義な議論をしていただいた Drapkin、Burns、Carr 研究室のメンバー、iMRM アッセイで使用される抗体および標準ペプチド試薬の評価を支援してくださった Alexandra Cocco、iMRM データの MSstats 分析を担当していただいた Sebastian Vaca、Mei に感謝いたします。 Zheng氏には免疫組織化学について、Adam Karpf博士（ネブラスカ大学）には有益な議論について、そしてAndrew Godwin博士には卵巣表面上皮細胞の寛大な提供について感謝の意を表した。

この研究は、卵巣癌研究同盟 (PRdS への 891470)、中国奨学金評議会 (YF)、リブキン センター (SMG) からのスカセル ファミリー科学学者賞、国立癌研究所 EDRN 5U01CA152990 からの Mentored Investigator Grant Program によって支援されました。 (1 ～ 5 年目はサブワード 217321、6 ～ 8 年目は 227914) (RD、MB、SC、SS、MG)、卵巣がんにおける NCI SPORE P50 CA228991 (RD)、名誉あるティナ ブロズマン卵巣がん研究財団 ( RD）、ミリアム・アンド・シェルドン・G・アデルソン博士医学研究財団（RD）、クラニール財団（RD）、がんの家族と友人のためのラン・アンド・ウォーク（RD）、治癒のための射撃（RD）、マギー記念碑基金（RD）、ヘレン・ロス・ボガッツ卵巣がん早期発見基金（RD）、マージョリー・S・スタネックおよびローウェル・H・ダブロウ卵巣がん研究センター寄付基金（RD）、バッサーBRCAセンター（RD）、およびマイク＆パティ・ヘネシー財団（RD）。

佐藤翔氏とマイケル・ジレット氏も同様に貢献しました。

ペン卵巣癌研究センター、ペンシルベニア大学、ペレルマン医科大学、フィラデルフィア、ペンシルバニア州、19104、米国

佐藤翔、パメラ・R・デ・サンティアゴ、イー・フェン、サラ・ホブ​​デイ、マリリン・A・ミッチェル、カイ・ドーベルスタイン、ステファン・M・ガイスラー、ロニー・ドラプキン

MIT およびハーバード大学のブロード研究所、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、02142、米国

マイケル・ジレット、エリック・クーン、マイケル・バージェス、クリステン・ドゥセット、ポール・J・イッポリティ、スティーブン・A・カー

マサチューセッツ総合病院、呼吸器および救命救急医学部門、ボストン、マサチューセッツ州、02114、米国

マイケル・ジレット

ブリガム・アンド・ウィメンズ病院病理学部、ボストン、マサチューセッツ州、02115、米国

ミシェル・S・ハーシュ

ペンシルベニア大学病院、病理学および検査医学部門、ペンシルバニア州フィラデルフィア、19104、米国

ローレン・シュワルツ

ハーバード大学医学部、ボストン、マサチューセッツ州、02115、米国

マイケル・ジレット、ミシェル・S・ハーシュ、スティーブン・J・スケート、キャスリーン・H・バーンズ、スティーブン・A・カー

アラバマ大学バーミンガム医学部、バーミンガム、アラバマ州、35233、米国

マイケル・J・ビラー

生物統計学と計算生物学、マサチューセッツ総合病院、米国マサチューセッツ州ボストン

スティーブン・J・スケート

米国マサチューセッツ州ボストンのダナ・ファーバー癌研究所腫瘍病理学部門

カルロス・メンデス＝ドランテス & キャスリーン・H・バーンズ

BRCA バッサーセンター、アブラムソンがんセンター、ペンシルベニア大学、ペレルマン医科大学、フィラデルフィア、ペンシルバニア州、19104、米国

ロニー・ドラプキン

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

SS、MG、RD がプロジェクトと実験計画を考案しました。 SS、EK、YF、PJI、MAM、MG、PRdS.、SH、SMG、CMD、KHB、RD が実験を実施し、結果を分析しました。 EK、MB、KD、PJI、MG、および SAC がプロテオミクス実験を開発、実行、分析しました。 MSH、LS、RD は組織と病理学の専門知識を提供しました。 SS は血漿サンプルと統計的サポートを提供しました。 著者全員が原稿の草稿とレビューを手伝ってくれました。 RD は研究全体の監督者を務めました。

ロニー・ドラプキンへの通信。

R. ドラプキンは、Repare Therapeutics および VOC Health の科学諮問委員会の委員を務めています。 他の著者は競合する利益を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

オープン アクセス この記事はクリエイティブ コモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブ コモンズ ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。 この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれています。 素材が記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。 このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

佐藤 S.、ジレット M.、デ サンティアゴ、PR 他高悪性度漿液性卵巣癌における候補バイオマーカーとしての LINE-1 ORF1p。 Sci Rep 13、1537 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-28840-5

引用をダウンロード

受信日: 2022 年 8 月 16 日

受理日: 2023 年 1 月 25 日

公開日: 2023 年 1 月 27 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-28840-5

次のリンクを共有すると、誰でもこのコンテンツを読むことができます。

申し訳ございませんが、現在この記事の共有リンクは利用できません。

Springer Nature SharedIt コンテンツ共有イニシアチブによって提供

コメントを送信すると、利用規約とコミュニティ ガイドラインに従うことに同意したことになります。 虐待的なもの、または当社の規約やガイドラインに準拠していないものを見つけた場合は、不適切としてフラグを立ててください。