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Mar 24, 2023

ウルトラ

Rapporti scientifici Volume 12,

Scientific Reports volume 12、記事番号: 16518 (2022) この記事を引用

840 アクセス

2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

超小型 (54 × 58 × 8.5 mm) と大口径 (1 × 7 mm) の 9 色分光計 (2 層として「二分割」された 10 枚のダイクロイック ミラーのアレイを使用) が開発され、スナップショット スペクトル イメージングに使用されました。 開口径より小さい断面の入射光束を、中心波長530、550、570、590、610、630、650、670、690の20nm幅の連続した波長帯域を持つ9色光束に分割んー。 9 つの色光束の画像がイメージ センサーによって同時に効率的に測定されます。 開発したダイクロイックミラーアレイは、従来のダイクロイックミラーアレイと異なり、独自の二分割構成を採用することで、同時に測定できる色数が増加するだけでなく、各色束の画像解像度も向上します。 開発した9色分光計は4キャピラリーアレイ電気泳動に使用されました。 各キャピラリー内を同時に移動する 8 つの色素が、9 色のレーザー誘起蛍光検出によって同時に定量されました。 9色分光計は超小型で安価であるだけでなく、高い光スループットとほとんどの分光イメージング用途に十分な分光分解能を備えているため、さまざまな分野で広く使用される可能性があります。

ハイパーおよびマルチスペクトル イメージングは​​、天文学 2、地球観察リモート センシング 3,4、食料および水の品質管理 5,6、美術品の保存と考古学 7、法医学 8、外科 9、生物医学の分析および診断 10,11 などの分野で不可欠な技術となっています。 、12、13。 視野内の各発光点から発せられる光のスペクトルを測定する方法は、(1) 点走査 (「泡立てほうき」)14,15、(2) 線走査 (「押しほうき」)16 に分類されます。 、17、18、(3) 波長スキャン19、20、21、および(4) スナップショット22、23、24、25。 これらすべての方法の場合、空間解像度、スペクトル解像度、時間解像度はトレードオフの関係にあります9、10、12、26。 さらに、光スループットは感度、つまりスペクトルイメージングにおける信号対雑音比に大きな影響を与えます26。 光のスループット、すなわち光利用効率は、各発光点から単位時間当たりに放射される測定対象波長帯域の光の総量に対する、実際に測定される光の量の比に比例する。 各発光点から発せられる光の強度やスペクトルが時間とともに変化する場合や、各発光点の位置が時間とともに変化する場合には、すべての発光点から発せられる光のスペクトルを測定するため、(4)の方法が適しています。同時に24．

上述の方法のほとんどは、カテゴリ (1)、(2)、および (4) の回折格子 18 またはプリズム 14、16、22、23 またはフィルター ホイール 20、21、液体を使用する大型、複雑、および/または高価な分光計と組み合わせられます。 – カテゴリ (3) の水晶調整可能フィルタ (LCTF)25、または音響光学調整可能フィルタ (AOTF)19。 対照的に、カテゴリ (4) の複数のダイクロイック ミラーを使用する分光計は、構成が簡単なため小型で安価です 27、28、29、30。 また、各ダイクロイックミラーで分割された両光（つまり、各ダイクロイックミラーへの入射光の透過光と反射光）を余すことなく利用し続けるため、光のスループットが高い。 ただし、同時に測定できる波長帯域（色）の数は 4 つ程度に制限されます26。

蛍光検出に基づくスペクトルイメージングは​​、生物医学的アッセイおよび診断における多重分析によく使用されます10、13。 多重分析では、複数種類の分析対象物（特定の DNA やタンパク質など）がそれぞれ異なる蛍光色素で標識されているため、各時刻における視野内の各発光点に存在する各分析対象物の量が多成分分析によって定量化されます。 、各時点で各発光点から発せられる蛍光の検出スペクトルを分離します31,32。 その手順中に、それぞれが異なる蛍光を発する異なる色素が共局在する、つまり空間的および時間的に共存することができます。 各色素を他の色素と区別できるように単一のレーザー ビームで励起できる色素の現在の最大数は 833 です。 この上限は、スペクトル分解能 (つまり、色の数) によって決まりません。蛍光スペクトルの幅 (≧ 50 nm) と、蛍光共鳴エネルギーが移動するときの色素のストークス シフトの大きさ (≦ 200 nm) によって決まります。 FRET)10を使用します。 ただし、染料のスペクトルの重なりを分離するには、色の数が染料の数以上でなければなりません31、32。 したがって、同時に測定する色数を８色以上に増やす必要がある。

最近、超小型の 7 色分光計（7 つのダイクロイック ミラー アレイと 4 つの蛍光束を測定するためのイメージ センサーを使用）が開発されました31。 この分光計は、回折格子やプリズムを使用する従来の分光計よりも 2 ～ 3 桁小型です 34,35。 しかし、分光計に 7 枚を超えるダイクロイックミラーを配列し、同時に 7 色を超える色を測定することは困難です 36,37。 ダイクロイックミラーの枚数が増えると、分割された色光束の光路長の最大差が大きくなり、すべての光束を同一センサー面上に結像することが困難になります。 光束の最長光路長も増加するため、分光器の開口幅（つまり、分光器によって分析される光の最大幅）が減少します。

上記課題に対し、本研究では、2層10枚ダイクロイックミラーアレイとイメージセンサーを用いたスナップ分光イメージング用の超小型9色分光器を開発した【カテゴリー(4)】 』を開発した。 開発した分光器は、従来の分光器に比べて最大光路長差が小さく、最長光路長が短くなりました31。 これを、9 色のレーザー誘起蛍光を検出するための 4 キャピラリー アレイ電気泳動に適用し、各キャピラリー内で同時に移動する 8 つの色素を同時に定量しました。 開発した分光器は、超小型かつ安価であるだけでなく、高い光スループットとほとんどの分光イメージング用途に十分な分光分解能を備えているため、さまざまな分野で広く使用することができます。

従来の 9 色分光計を図 1a に示します。 その設計は、以前の超小型 7 色分光器 31 の設計を踏襲しています。 右45度に傾斜した9枚のダイクロイックミラーを水平に並べて構成されており、9枚のダイクロイックミラーの上方にイメージセンサー(S)が配置されています。 下からの入射光束 (C0) は、9 枚のダイクロイック ミラー アレイによって上方向への 9 つの出射色光束 (C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、および C9) に分割されます。 9 つの色束すべてがイメージ センサーに直接入力され、同時に検出されます。 この研究では、C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9 は波長順に、それぞれマゼンタ、紫、青、シアン、緑、黄、オレンジ、赤オレンジ、赤で示されています。 。 本稿ではこれらの色表示を使用していますが、図3に示すように、人間の目で実際に観察される色とは異なります。

従来および新規の9色分光計の概略図。 (a) 9 枚のダイクロイック ミラー アレイを備えた従来の 9 色分光計。 (b) 2 層 2 分割 10 ダイクロイック ミラー アレイを備えた新しい 9 色分光計。 入射光束C0は9つの色光束C1〜C9に分割され、イメージセンサーSで検出されます。

2層の2分割10ダイクロイックミラーアレイとイメージセンサーを備えた開発された新しい9色分光計を図1bに示します。 下層には、１０枚のダイクロイックミラーアレイの中心から右に向かって５枚のダイクロイックミラーが右４５度に傾斜して配列されている。 上層には、他の５枚のダイクロイックミラーが左４５度に傾いて中央から左に向かって配列されている。 下層の一番左のダイクロイックミラーと上層の一番右のダイクロイックミラーが重なっています。 下からの入射光束 (C0) は、右側の 5 枚のダイクロイック ミラーによって 4 つの出射色光束 (C1 ～ C4) に分割され、左側の 5 つのダイクロイック ミラーによって 5 つの出射色光束 (C5 ～ C9) に分割されます。 従来の 9 色分光計と同様に、9 色すべての光束がイメージ センサー (S) に直接入力され、同時に検出されます。 図1aとbを比較すると、新しい9色分光計の場合、9色の光束の光路長の最大差と最長光路長の両方が半分になることがわかります。

幅29mm×奥行き31mm×高さ6mmという超小型サイズの2層2分割10枚ダイクロイックミラーアレイの詳細設計を図2に示します。ダイクロイックミラーアレイは、右側の5枚のダイクロイックミラー（M1～M5）と左側の5枚のダイクロイックミラー（M6～M9ともう1つのM5）で構成され、それぞれアルミ製のホルダーに固定されています。 全てのダイクロイックミラーは、光束がミラー３１を通過する際の屈折による光束の平行移動を補償するために、段階的に配列されている。 バンドパス フィルター (BP) は M1 の下に固定されています。 M1、BPのサイズは10mm（長辺）×1.9mm（短辺）×0.5mm（厚さ）です。 他のダイクロイックミラーは15mm×1.9mm×0.5mmです。 Ｍ１とＭ２の配列間隔は１．７ｍｍ、その他のダイクロイックミラーの配列間隔は１．６ｍｍである。 入射光束 C0 と 10 枚のダイクロイック ミラー アレイによって分割された 9 つの色光束 C1 ～ C9 が図 2c に重ねられています。

2 層の 2 つに分割された 10 ダイクロイック ミラー アレイの設計。 2層2分割10枚ダイクロイックミラーアレイ（サイズ29mm×31mm×6mm）の（a）斜視図、（b）断面図。 下層に配置された5枚のダイクロイックミラー(M1〜M5)、上層に配置された5枚のダイクロイックミラー(M6〜M9ともう1つのM5)、およびM1の下にバンドパスフィルタ(BP)で構成されます。 (c) C0とC1～C9を重ねて垂直方向から見た断面図。

図２ｃのＣ０の幅で示される水平方向の開口幅は１ｍｍであり、アルミニウムホルダの設計によって指定される図２ｃの面に垂直な方向の開口幅は７ｍｍである。 つまり、この新しい 9 色分光計は 1 mm × 7 mm という大きな開口サイズを持っています。 C4の光路長はC1〜C9の中で最も長く、上記の超小型サイズ（29mm×31mm×6mm）で規定される10ダイクロイックミラーアレイ内のC4の光路長は12んん。 一方、Ｃ１～Ｃ９の中でＣ５の光路長が最も短く、Ｃ５の光路長は５．７ｍｍである。 したがって、光路長の最大差は 6.3 mm になります。 上記光路長は、M1～M9、BP（石英製）を光が透過することにより光路長が伸びるように補正されています。

M1〜M9およびBPのスペクトル特性は、光束C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、およびC9が520〜540、540〜560、560〜580、580〜600の波長範囲を持つように設計されました。 、それぞれ600〜620、620〜640、640〜660、660〜680、および680〜700 nm。

作製した10枚の二色性ミラーアレイの写真を図3aに示します。 図ではM1とBPは裏側に隠れていますが、M1～M9とBPはそれぞれ45°の斜面とアルミホルダーの水平面に接着されています。

10枚のダイクロイックミラーアレイの作製とそのデモンストレーション。 (a) 作製した 10 枚のダイクロイック ミラー アレイ。 (b) 10 枚のダイクロイック ミラー アレイの前に置かれた紙に、後ろから白色光で照明された、サイズ 1 mm × 7 mm の 9 色のスプリット イメージ。 (c) 背面から白色光で照明された 10 枚のダイクロイック ミラー アレイ。 (d) 10 ダイクロイック ミラー アレイから放出される 9 色の分割光束。c の 10 ダイクロイック ミラー アレイの前にスモークを満たしたアクリルタンクを置き、部屋を暗くして観察します。

45°の入射角でのC0のM1〜M9と0°の入射角でのC0のBPの測定された透過スペクトルを図4aに示します。 C0に対するC1〜C9の透過スペクトルを図4bに示します。 これらのスペクトルは、図4aのスペクトルから、図1〜3のC1〜C9の光路に基づいて計算されました。 1bと2c。 たとえば、TS(C4) = TS (BP) × [1 − TS (M1)] × TS (M2) × TS (M3) × TS (M4) × [1 − TS (M5)]、および TS(C9) ) = TS (BP) × TS (M1) × [1 − TS (M6)] × TS (M7) × TS (M8) × TS (M9) × [1 − TS (M5)]、ここで TS(X) [1 − TS(X)] はそれぞれ X の透過スペクトルと反射スペクトルです。図 4b に示すように、C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8 の透過帯域 (透過率 50% 以上) 、C9 はそれぞれ 521 ～ 540、541 ～ 562、563 ～ 580、581 ～ 602、603 ～ 623、624 ～ 641、642 ～ 657、659 ～ 680、および 682 ～ 699 nm です。 これらの結果は、設計された波長帯域と一致しています。 また、C0の光利用効率は高く、C1～C9の平均最大透過率は92%です。

ダイクロイックミラーと分割された9色光束の透過スペクトル。 （a）入射角45°でのM1〜M9と入射角0°でのBPの測定された透過スペクトル。 (b) (a) から計算された C0 に対する C1 ～ C9 の透過スペクトル。

図３（ｃ）では、１０枚のダイクロイックミラーアレイを図３（ａ）の右側が上となるように立てて配置し、後方から平行光のＬＥＤ白色光束（Ｃ０）を照射する。 図 3a に示す 10 枚のダイクロイック ミラー アレイは、54 mm (高さ) × 58 mm (奥行き) × 8.5 mm (厚さ) のサイズのアダプター内に保持されています。 図３ｄは、図３ｃの状態に加え、１０枚のダイクロイックミラーアレイの前にスモークを満たしたアクリルタンクを置き、室内灯を消灯したものである。 その結果、10 枚のダイクロイック ミラー アレイから放出される 9 つの色分割光束がタンク内で見えるようになります。 各分割光束は 1 × 7 mm のサイズの長方形の断面を持ち、これは新しい 9 色分光計の開口サイズに対応します。 図3bは、図3cの10枚のダイクロイックミラーアレイの前に紙を置き、紙上に投影された9色分割光束の1×7mm像を紙の進行方向から観察したものです。 9 色のスプリットフラックス。 図３ｂおよび図３ｄにおける９つの色分割光束は、図３ａおよび図３ｂからも分かるように、上から下に順にＣ４、Ｃ３、Ｃ２、Ｃ１、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９である。 1bと2c。 これらはそれぞれの波長に対応した色で観察されます。 C9（682〜699 nm）に関しては、LED白色光の強度（補足図S3を参照）と図3の写真撮影に使用されたカラーカメラの感度が両方とも低いため、観察されたC9の強度（光束）下部）は他の分割フラックスよりも弱いです。 同様に、Ｃ９も肉眼でかすかに観察された。 一方、C2 (上から 2 番目のフラックス) は、図 3 では緑色に見えますが、肉眼ではもっと黄色に見えます。

図3cからdへの進行は、補足ビデオ1に示されています。LED白色光束が10ダイクロイックミラーアレイを透過した直後、それは同時に9つの色束に分割されます。 最終的にはタンク内の煙がタンクの上から下に向かって徐々に消えていくため、9色のスプリットフラックスも上から下に向かって順番に消えていきます。 これに対し、補足動画２では、１０枚のダイクロイックミラーアレイに入射する光束の波長を、６９０、６７１、６５０、６３２、６１０、５８９、５６８、５５０の順に長波長から短波長へと順次変化させた場合を示している。 、５３２ｎｍでは、９つの色分割光束のうち対応する色分割光束のみがＣ９、Ｃ８、Ｃ７、Ｃ６、Ｃ５、Ｃ４、Ｃ３、Ｃ２、Ｃ１の順に可視化される。 アクリルタンクを石英セルに置き換えると、各分割フラックスのシート形状が斜め上から鮮明に観察できるようになった。 また、補足ビデオ３は、補足ビデオ２の波長変更部分が繰り返し再生されるように編集されている。 これは、10 枚のダイクロイック ミラー アレイの特徴を最も雄弁に表現しています。

上記の結果は、作製した 10 枚のダイクロイック ミラー アレイ、または新しい 9 色分光計が設計通りに機能することを示しています。 新しい 9 色分光計は、10 ダイクロイック ミラー アレイとアダプターをイメージ センサー ボードに直接取り付けることによって形成されました。

図2cの紙面垂直方向に1mm間隔で配置された4つのφ50μm発光点から発せられた400～750nmの波長帯域の光束は、それぞれ用いた4レンズアレイにより平行光化された。以前の研究31,34。 4レンズアレイは焦点距離1.4mm、間隔1mmのφ1mmレンズ4枚で構成されています。 1 mm 間隔で配置された 4 つの平行光束 (4 つの C0) が、新しい 9 色分光計の BP に入射しました。 各光束 (C0) は、10 枚のダイクロイック ミラー アレイによって 9 つの色光束 (C1 ～ C9) に分割されました。 結果として得られた 36 光束 (C1 ～ C9 の 4 セット) は、10 ダイクロイック ミラー アレイに直接取り付けられた CMOS イメージ センサー (S) に直接入力されました。 その結果、図5aに示すように、最大​​光路長の差が小さく、最大光路長が短いため、36本の光束のすべての像が均一なサイズで同時に鮮明に検出されました。 入射光束のスペクトルに応じて（補足図S4を参照）、C1、C2、およびC3の4つのセットの画像強度は比較的低くなります。 36 枚の画像のサイズは 0.57 ± 0.05 mm (平均 ± 標準偏差) です。 したがって、像倍率は平均 11.4 倍になります。 平均して、垂直像間隔は１ｍｍ（レンズアレイ間隔と同じ）、水平像間隔は１．６ｍｍ（ダイクロイックミラーアレイ間隔と同じ）である。 このように、画像サイズが画像間隔に比べて十分に小さいため、各画像を独立して（低クロストークで）測定することができます。 一方、私たちの以前の研究で使用された従来の7色分光計によって検出された28のフラックスの画像31を図5bに示します。 7 枚のダイクロイック ミラー アレイは、図 1a の 9 枚のダイクロイック ミラー アレイから右端の 2 枚のダイクロイック ミラーを削除することによって作成されました。 すべての画像に焦点が合っているわけではなく、画像のサイズは C1 から C7 まで大きくなります。 28 枚の画像のサイズは 0.70 ± 0.19 mm です。 したがって、すべての画像において高い画像解像度を維持することは困難である。 図５ｂの２８枚の画像のサイズの変動係数（ＣＶ）は２８％であるのに対し、図５ａの３６枚の画像のサイズの変動係数（ＣＶ）は９％に減少する。 以上の結果より、新規の9色分光器により、同時に測定できる色数が7色から9色に増加しただけでなく、各色ごとに高い画像分解能が得られたことが明らかとなった。

従来の分光器と新規の分光器で形成されるスプリットイメージの品質の比較。 (a) 新しい 9 色分光計によって形成された 4 セットの 9 色分割画像 (C1 ～ C9)。 (b) 従来の 7 色分光計によって形成された 4 組の 7 色のスプリットイメージ (C1 ～ C7)。 4 つの発光点からの波長 400 ～ 750 nm の光束 (C0) をそれぞれ平行にして各分光計に入射しました。

9 色分光計の分光性能を実験的に評価しました。評価結果を図 6 に示します。なお、図 6a は図 5a と同じ結果を示しています。 つまり、4 つの C0 のそれぞれの波長が 400 ～ 750 nm の場合、36 枚の画像 (C1 ～ C9 の 4 セット) がすべて検出されました。 逆に、図6b-jに示すように、各C0が530、550、570、590、610、630、650、670、または690 nmの特定の波長を持っていた場合、対応する画像はほぼ4つだけ（4セットのC1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、またはC9）が検出されました。 ただし、図4bに示すC1〜C9の透過スペクトルがわずかに重複しており、方法で説明したように、特定の波長の各C0が10 nmの波長帯域を持っているため、4つの対応する画像に隣接するいくつかの画像は非常にかすかに検出されました。 これらの結果は、図4bおよび補足ビデオ2および3に示されているC1〜C9の透過スペクトルと一致しています。言い換えれば、9色分光計は図4bに示されている結果から予想どおりに機能します。 したがって、C1 ～ C9 の画像強度プロファイルは各 C0 の光スペクトルを表すと結論付けられます。

9色分光器の分光性能。 入射光（4つのC0）が（a）400〜750 nm（図5aと同様）、（b）の波長の光である場合に、新しい9色分光計によって形成された4セットの9色スプリットイメージ（C1〜C9）。 ) 530 nm、(c) 550 nm、(d) 570 nm、(e) 590 nm、(f) 610 nm、(g) 630 nm、(h) 650 nm、(i) 670 nm、(j)それぞれ690nm。

開発された 9 色分光計は、4 キャピラリー アレイ電気泳動に適用されました (詳細については補足資料を参照) 31、34、35。 4キャピラリーアレイとは、4本のキャピラリー（外径360μm、内径50μm）をレーザー照射位置に1mm間隔で配列したものです。 FL-6C (Dye1)、JOE-6C (Dye2)、dR6G (Dye3)、TMR-6C (Dye4)、CXR-6C (Dye5)、TOM-6C の 8 種類の色素で標識された DNA 断片を含むサンプル蛍光発光波長の短い順に、ＬＩＺ（Ｄｙｅ６）、ＬＩＺ（Ｄｙｅ７）、ＷＥＮ（Ｄｙｅ８）を４本のキャピラリー（以下、Ｃａｐ１、Ｃａｐ２、Ｃａｐ３、Ｃａｐ４）に分離した。 Cap1 ～ Cap4 からのレーザー誘起蛍光は、4 つのレンズ アレイによってコリメートされ、同時に 9 色分光計によって検出されました。 電気泳動中の9色（C1〜C9）の蛍光強度の時間経過、つまり各キャピラリーの9色エレクトロフェログラムを図7aに示します。 同等の 9 色のエレクトロフェログラムが Cap1 ～ Cap4 で得られました。 Cap1の図7aの矢印で示されているように、各9色のエレクトロフェログラムの8つのピークはそれぞれDye1〜Dye8の個別の蛍光発光を示しています。

4 キャピラリー アレイ電気泳動に使用される 9 色分光計による 8 つの色素の同時定量。 (a) 各キャピラリーの 9 色 (C1 〜 C9) エレクトロフェログラム。 Cap1 の矢印で示された 8 つのピークは、8 つの色素 (Dye1 ～ Dye8) の個別の蛍光発光を示します。 矢印の色は (b) と (c) の色に対応します。 (b) 各キャピラリーの 8 つの色素 (Dye1 ～ Dye8) の蛍光スペクトル。 c 各キャピラリーの 8 つの色素 (Dye1 − Dye8) エレクトロフェログラム。 Dye7 標識 DNA フラグメントのピークは、Cap4 の塩基長とともに矢印で示されています。

8つのピークにおけるC1〜C9の強度分布をそれぞれ図7bに示します。 C1〜C9とDye1〜Dye8は両方とも波長順であるため、図7bの8つの分布は、左から右の順にDye1〜Dye8の蛍光スペクトルを示しています。 この研究では、Dye1、Dye2、Dye3、Dye4、Dye5、Dye6、Dye7、Dye8 をそれぞれマゼンタ、紫、青、シアン、緑、黄、オレンジ、赤で示しています。 図７ａの矢印の色は、図７ｂの染料の色に対応していることに留意されたい。 図7bの各スペクトルのC1〜C9の蛍光強度は、それらの合計が1になるように正規化されています。 Cap1 ～ Cap4 によって 8 つの等価な蛍光スペクトルが得られます。 Dye1 〜 Dye8 間の蛍光スペクトルの重複が明確に観察されます。

図7cに示すように、各キャピラリーについて、図7aの9色エレクトロフェログラムは、図7bの8つの蛍光スペクトルに基づく多成分分析31によって8色素エレクトロフェログラムに変換されました（詳細は補足資料を参照）。 図7aの蛍光スペクトルの重複は図7cには現れないため、異なる量のDye1〜Dye8が同時に蛍光を発する場合でも、各時点でDye1〜Dye8を個別に識別して定量することが可能です。 従来の 7 色検出ではこれは不可能です 31。 しかし、開発された9色検出によりそれが可能になります。 Cap1の図7cの矢印で示されているように、Dye3（青）、Dye8（赤）、Dye5（緑）、Dye4（シアン）、Dye2（紫）、Dye1（マゼンタ）、およびDye6の蛍光発光の単一ピークのみが存在します。 (黄色) は予想どおり時系列順に観察されます。 Dye7（オレンジ）の蛍光発光は、オレンジの矢印で示した単一ピークの他に、複数の単一ピークが観察されます。 この結果は、サンプルにサイズ標準、つまりさまざまな塩基長の Dye7 標識 DNA 断片が含まれているという事実によるものです。 Cap4の図7cに示すように、これらの塩基長には、20、40、60、80、100、114、120、140、160、180、200、214、および220塩基長が含まれます。

開発した2層2分割10枚ダイクロイックミラーアレイを用いた9色分光器は、小型かつシンプルな構成が特長です。 図3cに示すアダプター内に保持されている10ダイクロイックミラーアレイはイメージセンサーボードに直接取り付けられているため（図S1およびS2を参照）、9色分光器のサイズは9色分光器のサイズと同じですアダプターのサイズ、つまり 54 × 58 × 8.5 mm (厚さ)。 この超小型サイズは、回折格子やプリズムを使用した従来の分光器のサイズに比べて 2 ～ 3 桁小さいです。 また、9色分光器はイメージセンサー面に対して垂直に光が入射するように構成されているため、顕微鏡、フローサイトメーター、顕微鏡などのシステム内で9色分光器のスペースを確保することが容易です。キャピラリ アレイ電気泳動アナライザを使用して、システムをさらに小型化します。 一方、9色分光器に使用される10枚のダイクロイックミラーとバンドパスフィルターのサイズは、わずか10×1.9×0.5mmまたは15×1.9×0.5mmです。 したがって、60mm角のダイクロイックミラーとバンドパスフィルターから、このような小型のダイクロイックミラーとバンドパスフィルターをそれぞれ100枚以上切り出すことができる。 したがって、１０枚のダイクロイックミラーアレイを低コストで製造することができる。

9色分光器のもう一つの特徴は、優れた分光性能です。 特に、スナップショットスペクトルイメージング、つまりスペクトル情報を含む画像の同時取得が可能になります。 各画像について、520 ～ 700 nm の波長範囲の連続スペクトルが 20 nm の解像度で得られます。 つまり、画像ごとに、520～700nmの波長範囲を均等に分割した20nmの9つの波長帯の9色の光強度が検出される。 ダイクロイックミラーとバンドパスフィルターの分光特性を変更することで、9つの波長帯域の波長範囲と各幅を調整することが可能です。 9 色検出は、スペクトル イメージングによる蛍光測定 (このレポートで説明されているとおり) だけでなく、スペクトル イメージングを使用する他の多くの一般的なアプリケーションでも役立ちます。 ハイパースペクトルイメージングでは何百もの色を検出できますが、検出される色の数が大幅に減ったとしても、多くのアプリケーションでは視野内の複数のターゲットを十分に高い精度で識別できることがわかっています38、39、40。 分光イメージングでは空間解像度、スペクトル解像度、時間解像度はトレードオフの関係にあるため、色数を減らすことで空間解像度と時間解像度を向上させることができます。 また、今回開発したような簡易な分光器を使用することも可能となり、計算負荷をさらに軽減することができます。

この研究では、9 色検出に基づいて 8 つの色素の重複する蛍光スペクトルをスペクトル分離することにより、8 つの色素を同時に定量しました。 時間的・空間的に共存する最大9種類の色素も同時に定量できます。 9 色分光計の特別な利点は、高い光スループットと大きな開口 (1 × 7 mm) です。 10 枚のダイクロイック ミラー アレイは、9 つ​​の波長帯域のそれぞれにおいて、開口部から入射する光の最大透過率 92% を備えています。 520～700nmの波長範囲における入射光の利用効率はほぼ100%です。 このような広い波長範囲においては、どのような回折格子を用いてもこれほど高い利用効率は得られない。 回折格子は特定の波長で 90% 以上の回折効率を持っていても、その波長と特定の波長の差が大きくなると、他の波長での回折効率は低下します41。 図 2c の紙面に垂直な方向の開口幅は、設計をわずかに変更することにより、7 mm からイメージ センサーの幅、たとえばこの研究で使用したイメージ センサーの場合は 13 mm まで拡張できます。 10枚のダイクロイックミラーアレイ。

9 色分光計は、この研究で示されているようにキャピラリー アレイ電気泳動だけでなく、他のさまざまなアプリケーションにも適用できます。 たとえば、以下に示すように、9 色分光計は蛍光顕微鏡に応用できます。 サンプル面は、10 倍の対物レンズによって 9 色分光計のイメージ センサー上に結像されます。 対物レンズとイメージセンサー間の光学距離は200mmですが、9色分光器の入射面とイメージセンサー間の光学距離はわずか12mmです。 したがって、画像は入射面でほぼ開口サイズ（1×7mm）に切り出され、9つのカラー画像に分割されます。 つまり、試料面上の0.1×0.7mmの領域を9色スナップショット分光イメージングすることが可能です。 さらに、図2cの水平方向に対物レンズに対して試料を走査することにより、試料面上のより広い領域の9色の分光イメージングが可能です。

10 枚のダイクロイック ミラー アレイのコンポーネント、つまり M1 ～ M9 および BP は、標準的な蒸着技術を使用して Asahi Spectra Co., Ltd. によって特注で製造されました。 誘電体材料の複数の薄層は、次の仕様を満たすように、厚さ 0.5 mm の 10 枚の 60 × 60 mm 石英プレート上にそれぞれ蒸着されました: M1: IA = 45°、520 ～ 590 nm で R ≧ 90%、Tave ≧ 90 610 ～ 700 nm で %。 M2: IA = 45°、520 ～ 530 nm で R ≧ 90%、550 ～ 600 nm で Tave ≧ 90%。 M3: IA = 45°、540 ～ 550 nm で R ≧ 90%、570 ～ 600 nm で Tave ≧ 90%。 M4: IA = 45°、560 ～ 570 nm で R ≧ 90%、590 ～ 600 nm で Tave ≧ 90%。 M5: IA = 45°、580 ～ 600 nm で R ≧ 98%、680 ～ 700 nm で R ≧ 98%。 M6: IA = 45°、600 ～ 610 nm で Tave ≧ 90%、630 ～ 700 nm で R ≧ 90%。 M7: IA = 45°、620 ～ 630 nm で R ≧ 90%、650 ～ 700 nm で Tave ≧ 90%。 M8: IA = 45°、640 ～ 650 nm で R ≧ 90%、670 ～ 700 nm で Tave ≧ 90%。 M9: IA = 45°、650 ～ 670 nm で R ≧ 90%、690 ～ 700 nm で Tave ≧ 90%。 BP: IA = 0°、505 nm で T ≤ 0.01%、530 ～ 690 nm で Tave ≧ 95%、530 ～ 690 nm で T ≧ 90%、725 ～ 750 nm で T ≤ 1%、ここで IA、T、 Tave、Rは非偏光の入射角、透過率、平均透過率、反射率です。

LED光源（AS 3000、アズワン株式会社）から出射された波長範囲400～750nmの白色光（C0）を平行光にして10枚ダイクロイックミラーアレイのBPに垂直に入射した。 LED白色光のスペクトルを補足図S3に示します。 アクリルタンク (サイズ 150 × 150 × 30 mm) を 10 枚のダイクロイック ミラー アレイの直前、BP の反対側に配置しました。 次に、ドライアイスを水に浸して作った煙をアクリルタンクに注ぎ、10枚のダイクロイックミラーアレイから放射されるC1〜C9の9色分割光束を可視化しました。

あるいは、平行白色光束 (C0) は、BP に入射する前に 1 つのフィルターを通過しました。 フィルターは当初、OD 0.6 の ND フィルターでした。 次に、電動フィルターホイール (FW212C、FW212C、 Thorlabs, Inc.）。 最後にNDフィルターを元に戻しました。 9 つのバンドパス フィルターの透過帯域は、それぞれ C9、C8、C7、C6、C5、C4、C3、C2、C1 の透過帯域に対応します。 内径 40 (光学長) × 42.5 (高さ) × 10 mm (幅) の石英セルを、10 枚のダイクロイック ミラー アレイの直前、BP の反対側に配置しました。 次に、石英セル内の煙濃度が維持されるようにチューブを通して石英セルに煙を供給し、10 枚の二色性ミラーアレイから放出される C1 ～ C9 の 9 色分割光束を可視化しました。

10 枚のダイクロイック ミラー アレイから放出される 9 色の分割光束のビデオは、iPhone XS のタイムラプス モードで撮影されました。 シーンの画像は 1 秒あたり 1 フレームでキャプチャされ、画像は 30 フレーム/秒 (補足ビデオ 1 の場合) または 24 フレーム/秒 (補足ビデオ 2 および 3 の場合) でビデオを作成するために編集されました。

拡散板上に厚さ50μmのステンレスシート（φ50μmのピンホールを1mm間隔で4個設けた）を設置した。 拡散板にはハロゲンランプの光をカットオフ波長700nmのショートパスフィルターを通過させた400～750nmの波長帯域の光を照射した。 光のスペクトルを補足図S4に示します。 あるいは、中心波長が 530、550、570、590、610、630、650、670、690 nm の 10 nm バンドパス フィルターのいずれかを光に通し、拡散板に照射しました。 その結果、拡散板と対向するステンレスシート上に、様々な波長を有するφ50μmの発光点が4つ形成された。

４つのレンズアレイを備えた４つのキャピラリーアレイを、図１および図２に示すように９色分光計に取り付けた。 S1とS2。 4 つのキャピラリー アレイと 4 つのレンズ アレイは、以前の研究で使用されたものと同じです 31,34。 505nm、出力15mWのレーザー光を4本のキャピラリーの発光点に側面方向から同時に均一に照射した。 各発光点から発せられた蛍光は、対応するレンズによってコリメートされ、10 枚のダイクロイック ミラー アレイによって 9 つの色光束に分割されます。 得られた 36 光束を CMOS イメージセンサー (C11440-52U、浜松ホトニクス株式会社) に直接入力し、同時に画像を検出しました。

各キャピラリーについて、PowerPlex® 6C Matrix Standard (Promega Corporation) 1 μl、ABI PRISM® BigDye® Primer Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems) の A Mix 1 μl、4 μl を混合することにより、20 μl サンプルを調製しました。 GeneScan™ 600 LIZ™ 色素サイズスタンダード v2.0 (Thermo Fisher Scientific) および 14 μl の水。 PowerPlex® 6C Matrix Standard には、最大発光波長の順に FL-6C、JOE-6C、TMR-6C、CXR-6C、TOM-6C、WEN の 6 つの色素でそれぞれ標識された 6 つの DNA フラグメントが含まれています。 これらのDNA断片の塩基長は開示されていないが、WEN、CXR-6C、TMR-6C、JOE-6C、FL-6C、TOM-6Cで標識されたDNA断片は塩基長の順であることが知られている。 ABI PRISM® BigDye® Primer Cycle Sequencing Ready Reaction Kit の A Mix には、色素 dR6G で標識された DNA フラグメントが含まれています。 DNA断片の塩基長も開示されていない。 GeneScan™ 600 LIZ™ 色素サイズ スタンダード v2.0 には、色素 LIZ で標識された 36 個の DNA フラグメントが含まれています。 これらのDNA断片の塩基長は、20、40、60、80、100、114、120、140、160、180、200、214、220、240、250、260、280、300、314、320、340、 360、380、400、414、420、440、460、480、500、514、520、540、560、580、および 600 塩基。 サンプルを 94 °C で 3 分間変性させ、氷上で 5 分間冷却しました。 サンプルは各キャピラリーに 26 V/cm で 9 秒間注入され、有効長 36 cm の POP-7™ ポリマー溶液 (Thermo Fisher Scientific) で満たされた各キャピラリー内で 181 V/cm で分離されました。 60℃。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開された記事とその補足情報に含まれています。 この研究に関連する追加データは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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原稿に関して貴重なコメントをいただきました株式会社日立製作所の柳川善光氏と酒井智之氏に感謝いたします。

Research & Development Group, Hitachi Ltd., 1-280 Higashi-koigakubo, Kokubunji, Tokyo, 185-8601, Japan

Takashi Anazawa

株式会社日立ハイテク 分析・医療ソリューション事業グループ 〒312-8504 茨城県ひたちなか市市毛882

Shuhei Yamamoto & Ryoji Inaba

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TA は分光計を発明、開発し、実験を行い、データを分析し、原稿を書きました。 SY と RI は結果について話し合い、原稿をレビューしました。

穴澤隆氏への対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

補足ビデオ1.

補足ビデオ2.

補足ビデオ3.

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受信日: 2022 年 5 月 10 日

受理日: 2022 年 9 月 19 日

公開日: 2022 年 10 月 3 日

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